대장균에서 DNA를 분리하는 것은 분자 생물학의 기본 절차입니다. 이 기사는 전체 과정을 안내하여 자세한 단계와 설명을 제공하여 과학과 절차의 실질적인 측면을 모두 이해하도록합니다. 당신이 노련한 연구원이든 실험실의 신입생이든,이 가이드는 귀중한 자원이 될 것입니다.
세포 현탁액의 준비
● 대장균 세포 수집
대장균으로부터 DNA를 분리하는 첫 번째 단계는 박테리아 세포를 수집하는 것과 관련이있다. 이것은 일반적으로 로그 성장 단계에 도달 할 때까지 적합한 액체 배지에서 대장균을 성장시켜야합니다. 이 단계의 세포는 가장 실용적이고 용해하기 쉽기 때문에 타이밍이 중요합니다.
● 적절한 완충액에 셀을 재현 탁합니다
이어서, 수집 된 세포를 적합한 완충액에 재현 탁시킨다. 일반적인 선택은 TRIS - EDTA (TE) 버퍼이며, 이는 추출 과정에서 DNA의 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다. 완충제는 여러 목적을 제공합니다. PH를 안정화시키고, DNA를 분해 할 수있는 이온성 이온을 제공하며, 후속 효소 반응을위한 최적의 이온 환경을 제공합니다.
펠렛 세포로의 원심 분리
● 원심 분리를위한 매개 변수 (속도 및 시간)
세포를 재현 탁 한 후, 현탁액은 원심 분리되어 세포를 펠릿한다. 원심 분리 속도와 시간은 중요한 매개 변수입니다. 전형적으로, 원심 분리는 약 4,000 - 6,000g에서 4 ℃에서 10 - 15 분 동안 수행된다. 이것은 세포가 원심 분리 튜브의 바닥에 단단한 펠렛을 형성하도록한다.
● 적절한 펠릿의 중요성
세포를 성장 배지 및 기타 가용성 성분으로부터 분리하려면 적절한 펠렛 팅이 필수적입니다. 잘 형성된 펠렛은 후속 단계를보다 쉽고 효율적으로하여 세포의 최소 손실을 보장하고, 따라서 최대 DNA 수율을 보장합니다.
상청액 제거
● 상청액 제거 기술
세포가 펠릿이 나면, 상청액 (펠렛 위의 액체)은 세포 펠렛을 방해하지 않고 조심스럽게 제거해야한다. 이것은 일반적으로 마이크로 피펫을 사용하여 수행됩니다. 세포를 잃지 않도록이 단계를 세 심하게 수행하는 것이 중요합니다.
● 세포 펠렛의 최소 손실 보장
세포 펠렛의 최소 손실을 보장하려면 신중한 피펫 팅 및 필요한 경우 여러 라운드의 원심 분리 및 상청액 제거가 포함됩니다. 목표는 최대 DNA 회복을 위해 가능한 한 많은 세포를 펠렛에 유지하는 것입니다.
핵 용해 용액의 첨가
● 핵 용해 솔루션의 구성 요소
핵 용해 용액은 일반적으로 세제 (예 : SDS), 완충제 (예 : Tris - HCl) 및 킬레이트 제 (예 : EDTA)를 포함합니다. 세제는 DNA를 포함한 세포 함량을 용액으로 방출하여 세포막 및 핵 외피를 방해합니다.
● 세포벽을 분해하는 역할
핵 용해 용액은 세포막을 용해시킬뿐만 아니라 단백질과 지질을 변성시켜 세포벽과 핵 외피를 효과적으로 분해하여 DNA를 용액으로 방출합니다.
세포의 재현 탁
● DNA 전단을 피하기 위해 부드러운 피펫 팅
일단 핵 용해 용액이 첨가되면, DNA 전단을 피하기 위해 세포를 부드럽게 재현 탁해야한다. 전단은 DNA를 작은 조각으로 파괴 할 수 있으며, 이는 높은 분자 - 중량 DNA가 필요한 다운 스트림 응용에 문제가 될 수 있습니다.
● 완전한 재현 탁 보장
완전한 재현 탁은 모든 세포가 균일하게 용해되어 DNA 회복을 최대화합니다. 이것은 온화한 피펫 팅 또는 저속으로 용액을 소용돌이 치면 달성 할 수 있습니다.
세포를 수용하여 인큐베이션합니다
● 인큐베이션을위한 온도 설정
재현 탁 된 세포는 완전한 용해를 보장하기 위해 특정 온도에서 인큐베이션된다. 이것은 일반적으로 37 ° C ~ 55 ° C에서 수행됩니다. 정확한 온도와 지속 시간은 프로토콜과 사용중인 DNA 분리 키트의 특정 요구 사항에 따라 달라질 수 있습니다.
● 효과적인 용해에 필요한 기간
인큐베이션의 전형적인 지속 시간은 20 분에서 30 분 사이이지만, 관찰 된 세포 용해의 효율에 따라 조정할 수 있습니다. 완전한 용해에 장기간 배양이 필요할 수 있지만 DNA 분해의 위험과 균형을 이루어야합니다.
실온으로 냉각
● 점진적인 냉각의 중요성
인큐베이션 후, 용 해물은 점차 실온으로 냉각된다. 점진적인 냉각은 DNA를 안정화시키는 데 도움이되고 열 충격의 위험을 최소화하여 잠재적으로 DNA를 분해 할 수 있습니다.
● DNA 및 세포 잔해에 미치는 영향
실온으로 냉각하면 세포 파편이 침전 될 수 있으므로 후속 단계에서 DNA를 더 쉽게 분리 할 수 있습니다. 이것은 또한 효소 활성을 안정화시키고 RNase 처리에 의해 RNA의 제거를 촉진하는 데 도움이된다.
RNase 용액의 첨가
● 절차에서 RNase의 목적
RNASE 용액은 RNA를 분해하기 위해 첨가되며, 그렇지 않으면 DNA와 함께 정제하고 다운 스트림 응용을 방해 할 수 있습니다. RNase는 선택적으로 RNA를 소화하여 DNA를 그대로 유지합니다.
● RNA 오염 방지
RNA 오염을 방지하는 것은 PCR 및 시퀀싱과 같은 순수한 DNA가 필요한 응용에 중요합니다. RNase 처리는 단리 된 DNA에 RNA 오염 물질이 없도록합니다.
DNA의 정제
● 다른 세포 성분으로부터 DNA를 분리하는 방법
용 해물로부터 DNA를 정화하기 위해 몇 가지 방법을 사용 할 수 있습니다. 여기에는 페놀 - 클로로포름 추출, 에탄올 침전 및 상업용 대장균 DNA 키트 사용이 포함됩니다. 각 방법에는 장단점이 있으며 상용 키트는 편의성과 일관된 결과를 제공합니다.
● DNA 순도에 대한 고려 사항
순도는 다운 스트림 애플리케이션의 성공을위한 중요한 요소입니다. 세포 요법 대장균 DNA 키트와 같은 상업용 키트는 단백질, 지질 및 기타 오염 물질을 효과적으로 제거함으로써 고 순도 DNA를 생성하도록 설계되었습니다.
분리 된 DNA의 저장 및 취급
● DNA 저장을위한 모범 사례
일단 정제되면, DNA는 긴 기간 저장을 위해 - 20 ° C 또는 - 80 ° C에서 TE 완충액과 같은 적합한 완충제에 저장해야합니다. DNA 분해를 일으킬 수 있으므로 빈번한 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.
● 다운 스트림 응용 분야의 DNA 무결성 유지
DNA 무결성을 유지하려면 멸균, 뉴 클레아 제 - 프리 튜브 및 용액을 사용하십시오. 이를 통해 DNA가 오염되지 않은 상태로 유지되고 클로닝, 시퀀싱 및 PCR과 같은 응용 분야에 적합합니다.
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후 시간 : 2024 - 09 - 05 14:47:03
