Выделение ДНК из E. coli — фундаментальная процедура молекулярной биологии. Эта статья проведет вас через весь процесс, предоставив подробные шаги и объяснения, гарантируя, что вы поймете как научные, так и практические аспекты процедуры. Независимо от того, являетесь ли вы опытным исследователем или новичком в лаборатории, это руководство станет ценным ресурсом.
Приготовление клеточной суспензии
● Сбор клеток E. coli.
Первый шаг в выделении ДНК из E. coli включает сбор бактериальных клеток. Обычно для этого требуется выращивать E. coli в подходящей жидкой среде до тех пор, пока она не достигнет логарифмической фазы роста. Время имеет решающее значение, поскольку клетки на этой фазе наиболее жизнеспособны и их легче лизировать, что приведет к более высокому выходу ДНК.
● Ресуспендирование клеток в соответствующем буфере.
Собранные клетки затем ресуспендируют в подходящем буфере. Распространенным выбором является буфер Tris-EDTA (TE), который помогает поддерживать целостность ДНК во время процесса экстракции. Буфер служит нескольким целям: он стабилизирует pH, хелатирует двухвалентные катионы, которые в противном случае могли бы разрушить ДНК, и обеспечивает оптимальную ионную среду для последующих ферментативных реакций.
Центрифугирование клеток осадка
● Параметры центрифугирования (скорость и время).
После ресуспендирования клеток суспензию подвергают центрифугированию для осаждения клеток. Скорость и время центрифугирования являются критическими параметрами. Обычно центрифугирование проводят при примерно 4000-6000 g в течение 10–15 минут при 4°C. Это гарантирует, что клетки образуют плотный осадок на дне центрифужной пробирки.
● Важность правильного гранулирования
Правильное гранулирование необходимо для отделения клеток от питательной среды и других растворимых компонентов. Хорошо сформированный осадок делает последующие этапы более простыми и эффективными, обеспечивая минимальную потерю клеток и, следовательно, максимальный выход ДНК.
Удаление супернатанта
● Методы удаления супернатанта.
После осаждения клеток надосадочную жидкость (жидкость над осадком) необходимо осторожно удалить, не повреждая осадок клеток. Обычно это делается с помощью микропипетки. Крайне важно выполнить этот шаг тщательно, чтобы не потерять клетки.
● Обеспечение минимальной потери клеточного осадка.
Обеспечение минимальной потери клеточного осадка включает осторожное пипетирование и, при необходимости, несколько циклов центрифугирования и удаление супернатанта. Цель состоит в том, чтобы сохранить как можно больше клеток в осадке для максимального восстановления ДНК.
Добавление раствора для лизиса ядер
● Компоненты раствора для лизиса ядер.
Раствор для лизиса ядер обычно содержит детергент (например, SDS), буфер (например, Tris - HCl) и хелатирующий агент (например, ЭДТА). Детергент разрушает клеточную мембрану и ядерную оболочку, высвобождая клеточное содержимое, включая ДНК, в раствор.
● Роль в разрушении клеточных стенок
Раствор для лизиса ядер не только лизирует клеточную мембрану, но также денатурирует белки и липиды, эффективно разрушая клеточные стенки и ядерные оболочки и высвобождая ДНК в раствор.
Ресуспендирование клеток
● Аккуратное пипетирование во избежание разрыва ДНК.
После добавления раствора для лизиса ядер клетки необходимо осторожно ресуспендировать, чтобы избежать сдвига ДНК. Сдвиг может разбить ДНК на более мелкие фрагменты, что может быть проблематично для последующих приложений, требующих ДНК с высокой молекулярной массой.
● Обеспечение полной ресуспензии
Полное ресуспендирование гарантирует равномерный лиз всех клеток и максимальное восстановление ДНК. Этого можно добиться путем осторожного пипетирования или встряхивания раствора на низкой скорости.
Инкубация для лизирования клеток
● Настройки температуры для инкубации.
Ресуспендированные клетки инкубируют при определенной температуре для обеспечения полного лизиса. Обычно это делается при температуре от 37°C до 55°C. Точная температура и продолжительность могут варьироваться в зависимости от протокола и конкретных требований используемого набора для выделения ДНК.
● Продолжительность, необходимая для эффективного лизиса.
Типичная продолжительность инкубации составляет от 20 до 30 минут, но ее можно регулировать в зависимости от наблюдаемой эффективности лизиса клеток. Для полного лизиса может потребоваться длительная инкубация, но она должна быть сбалансирована с учетом риска деградации ДНК.
Охлаждение до комнатной температуры
● Важность постепенного охлаждения.
После инкубации лизат постепенно охлаждают до комнатной температуры. Постепенное охлаждение помогает стабилизировать ДНК и сводит к минимуму риск термического шока, который потенциально может разрушить ДНК.
● Воздействие на ДНК и клеточный мусор.
Охлаждение до комнатной температуры позволяет клеточному мусору осаждаться, что облегчает разделение ДНК на последующих этапах. Это также помогает стабилизировать активность ферментов и облегчает удаление РНК путем обработки РНКазой.
Добавление раствора РНКазы
● Назначение РНКазы в процедуре.
Раствор РНКазы добавляется для разрушения РНК, которая в противном случае могла бы очищаться совместно с ДНК и мешать последующим приложениям. РНКаза избирательно расщепляет РНК, оставляя ДНК нетронутой.
● Предотвращение загрязнения РНК
Предотвращение загрязнения РНК имеет решающее значение для приложений, требующих чистой ДНК, таких как ПЦР и секвенирование. Обработка РНКазой гарантирует, что выделенная ДНК не содержит примесей РНК.
Очистка ДНК
● Методы отделения ДНК от других клеточных компонентов.
Для очистки ДНК из лизата можно использовать несколько методов. К ним относятся экстракция фенолом и хлороформом, осаждение этанолом и использование коммерческих наборов ДНК E. coli. У каждого метода есть свои плюсы и минусы, а коммерческие наборы предлагают удобство и стабильные результаты.
● Вопросы чистоты ДНК.
Чистота является решающим фактором для успеха последующих приложений. Коммерческие наборы, такие как набор ДНК E. coli Cell Therapy, предназначены для получения ДНК высокой чистоты путем эффективного удаления белков, липидов и других загрязнений.
Хранение и обращение с изолированной ДНК
● Лучшие практики хранения ДНК.
После очистки ДНК следует хранить в подходящем буфере, например буфере TE, при -20°C или -80°C для длительного хранения. Избегайте частых циклов замораживания-оттаивания, поскольку они могут вызвать деградацию ДНК.
● Поддержание целостности ДНК для последующих приложений.
Чтобы сохранить целостность ДНК, используйте стерильные пробирки и растворы, не содержащие нуклеазы. Это гарантирует, что ДНК останется незагрязненной и пригодной для таких применений, как клонирование, секвенирование и ПЦР.
ОBlueKit
Jiangsu Hillgene открыла свою штаб-квартиру (10 000㎡ заводов GMP и центр исследований и разработок) в Сучжоу, расположенном в районе Учжун, Сучжоу, городе на берегу прекрасного озера Тайху, а также две производственные площадки в Шэньчжэне и Шанхае, расширяя свою производственную сеть по всей стране. Площадка в Северной Каролине в США в настоящее время находится в стадии строительства, что еще больше расширяет ее глобальное присутствие. Компания Hillgene создала экспресс-путь для разработки продуктов клеточной терапии, от открытия до доставки, с платформами для производства нуклеиновых кислот, бессывороточного суспензионного культивирования, разработки закрытых процессов и контроля качества. Продукты BlueKit предназначены для контроля качества, обеспечивая успех инноваций в области клеточной терапии.
Время публикации: 2024-09-05 14:47:03
