يعد عزل الحمض النووي من الإشريكية القولونية إجراءً أساسيًا في البيولوجيا الجزيئية. سترشدك هذه المقالة خلال العملية بأكملها، وستقدم خطوات وشروحات مفصلة، مما يضمن فهمك للجوانب العلمية والعملية للإجراء. سواء كنت باحثًا متمرسًا أو وافدًا جديدًا إلى المختبر، سيكون هذا الدليل مصدرًا قيمًا.
إعداد تعليق الخلية
● مجموعة من خلايا الإشريكية القولونية
تتضمن الخطوة الأولى في عزل الحمض النووي من الإشريكية القولونية جمع الخلايا البكتيرية. وهذا يتطلب عادة زراعة الإشريكية القولونية في وسط سائل مناسب حتى تصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي. التوقيت أمر بالغ الأهمية لأن الخلايا في هذه المرحلة هي الأكثر قابلية للحياة وأسهل للليز، الأمر الذي سيؤدي إلى ارتفاع إنتاج الحمض النووي.
● إعادة تعليق الخلايا في مخزن مؤقت مناسب
ثم يتم إعادة تعليق الخلايا المجمعة في منطقة عازلة مناسبة. الاختيار الشائع هو المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE)، الذي يساعد في الحفاظ على سلامة الحمض النووي أثناء عملية الاستخراج. يخدم المخزن المؤقت أغراضًا متعددة: فهو يعمل على استقرار الرقم الهيدروجيني، ويخلب الكاتيونات ثنائية التكافؤ التي يمكن أن تؤدي إلى تحلل الحمض النووي، ويوفر بيئة أيونية مثالية للتفاعلات الأنزيمية اللاحقة.
الطرد المركزي لخلايا بيليه
● معلمات الطرد المركزي (السرعة والوقت)
بعد إعادة تعليق الخلايا، يتعرض المعلق للطرد المركزي لتكوير الخلايا. سرعة الطرد المركزي والوقت هي المعلمات الحاسمة. عادة، يتم إجراء الطرد المركزي عند حوالي 4000-6000 جم لمدة 10-15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. وهذا يضمن أن الخلايا تشكل بيليه ضيقة في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي.
● أهمية التكوير السليم
يعد التكوير المناسب ضروريًا لفصل الخلايا عن وسط النمو والمكونات القابلة للذوبان الأخرى. إن الحبيبات المشكلة جيدًا تجعل الخطوات اللاحقة أسهل وأكثر كفاءة، مما يضمن الحد الأدنى من فقدان الخلايا، وبالتالي الحد الأقصى من إنتاج الحمض النووي.
إزالة طاف
● تقنيات إزالة الطاف
مرة واحدة يتم تكوير الخلايا، يجب إزالة المادة طافية (السائل فوق بيليه) بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. ويتم ذلك عادةً باستخدام الماصة الدقيقة. من الضروري تنفيذ هذه الخطوة بدقة لتجنب فقدان أي خلايا.
● ضمان الحد الأدنى من فقدان بيليه الخلية
ضمان الحد الأدنى من فقدان بيليه الخلية ينطوي على بيبيتينج دقيق، وإذا لزم الأمر، جولات متعددة من الطرد المركزي وإزالة المادة طافية. الهدف هو الحفاظ على أكبر عدد ممكن من الخلايا في الحبيبة لتحقيق أقصى قدر من استعادة الحمض النووي.
إضافة محلول تحلل النوى
● مكونات محلول تحلل النواة
يحتوي محلول تحلل النواة عادةً على منظف (مثل SDS)، ومخزن مؤقت (مثل Tris-HCl)، وعامل خالب (مثل EDTA). يعطل المنظف غشاء الخلية والغلاف النووي، ويطلق المحتويات الخلوية، بما في ذلك الحمض النووي، في المحلول.
● دور في تحطيم جدران الخلايا
لا يؤدي محلول تحلل النواة إلى تحلل غشاء الخلية فحسب، بل يؤدي أيضًا إلى تغيير طبيعة البروتينات والدهون، مما يؤدي بشكل فعال إلى تكسير جدران الخلايا والأظرف النووية لإطلاق الحمض النووي في المحلول.
إعادة تعليق الخلايا
● سحب لطيف لتجنب قص الحمض النووي
بمجرد إضافة محلول تحلل النوى، تحتاج الخلايا إلى إعادة تعليقها بلطف لتجنب قص الحمض النووي. يمكن أن يؤدي القص إلى تقسيم الحمض النووي إلى أجزاء أصغر، مما قد يمثل مشكلة بالنسبة للتطبيقات النهائية التي تتطلب حمضًا نوويًا عالي الوزن الجزيئي.
● ضمان إعادة التعليق الكامل
إعادة التعليق الكامل يضمن أن جميع الخلايا يتم التخلص منها بشكل موحد، مما يزيد من استعادة الحمض النووي. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق الأنابيب لطيف أو دوامة الحل بسرعة منخفضة.
الحضانة لخلايا ليز
● إعدادات درجة الحرارة للحضانة
يتم تحضين الخلايا المُعلقة عند درجة حرارة محددة لضمان التحلل الكامل. يتم ذلك عادة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية إلى 55 درجة مئوية. يمكن أن تختلف درجة الحرارة والمدة الدقيقة اعتمادًا على البروتوكول والمتطلبات المحددة لمجموعة عزل الحمض النووي المستخدمة.
● المدة المطلوبة للتحلل الفعال
تتراوح المدة النموذجية للحضانة بين 20 إلى 30 دقيقة، ولكن يمكن تعديلها بناءً على كفاءة تحلل الخلايا التي تمت ملاحظتها. قد تكون الحضانة المطولة ضرورية للتحلل الكامل ولكن يجب أن تكون متوازنة مع خطر تدهور الحمض النووي.
التبريد إلى درجة حرارة الغرفة
● أهمية التبريد التدريجي
بعد الحضانة، يتم تبريد المحللة تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة. يساعد التبريد التدريجي في تثبيت الحمض النووي ويقلل من خطر الصدمة الحرارية، التي قد تؤدي إلى تدهور الحمض النووي.
● التأثيرات على الحمض النووي والحطام الخلوي
التبريد إلى درجة حرارة الغرفة يسمح للحطام الخلوي بالترسيب، مما يجعل من السهل فصل الحمض النووي في الخطوات اللاحقة. يساعد هذا أيضًا على تثبيت أنشطة الإنزيم ويسهل إزالة الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق علاج RNase.
إضافة الحل رناسي
● الغرض من RNase في الإجراء
تتم إضافة محلول RNase لتحلل الحمض النووي الريبي (RNA)، والذي يمكن أن ينقي مع الحمض النووي ويتداخل مع التطبيقات النهائية. RNase يهضم الحمض النووي الريبي (RNA) بشكل انتقائي، ويترك الحمض النووي سليمًا.
● منع تلوث الحمض النووي الريبي (RNA).
يعد منع تلوث الحمض النووي الريبي (RNA) أمرًا بالغ الأهمية للتطبيقات التي تتطلب الحمض النووي النقي، مثل PCR والتسلسل. يضمن علاج RNase خلو الحمض النووي المعزول من ملوثات الحمض النووي الريبي (RNA).
تنقية الحمض النووي
● طرق فصل الحمض النووي عن المكونات الخلوية الأخرى
يمكن استخدام عدة طرق لتنقية الحمض النووي من المحللة. وتشمل هذه استخراج الفينول والكلوروفورم، وترسيب الإيثانول، واستخدام مجموعات الحمض النووي للإشريكية القولونية التجارية. كل طريقة لها إيجابياتها وسلبياتها، حيث توفر المجموعات التجارية الراحة والنتائج المتسقة.
● اعتبارات لنقاء الحمض النووي
النقاء هو عامل حاسم لنجاح التطبيقات النهائية. تم تصميم المجموعات التجارية، مثل مجموعة العلاج بالخلايا E. coli DNA Kit، لإنتاج حمض نووي عالي النقاء عن طريق إزالة البروتينات والدهون والملوثات الأخرى بشكل فعال.
تخزين ومعالجة الحمض النووي المعزول
● أفضل الممارسات لتخزين الحمض النووي
بمجرد تنقيته، يجب تخزين الحمض النووي في مخزن مؤقت مناسب، مثل المخزن المؤقت TE، عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة لأنها يمكن أن تسبب تدهور الحمض النووي.
● الحفاظ على سلامة الحمض النووي للتطبيقات النهائية
للحفاظ على سلامة الحمض النووي، استخدم أنابيب ومحاليل معقمة وخالية من نوكلياز. وهذا يضمن بقاء الحمض النووي غير ملوث ومناسب لتطبيقات مثل الاستنساخ والتسلسل وPCR.
حولبلوكيت
أنشأت شركة Jiangsu Hillgene مقرها الرئيسي (10000 متر مربع من مصانع GMP ومركز البحث والتطوير) في سوتشو، الواقعة في منطقة Wuzhong، Suzhou، وهي مدينة على ضفاف بحيرة Taihu الجميلة، وموقعين للتصنيع في Shenzhen وShanghai، مما أدى إلى توسيع شبكة التصنيع الخاصة بها على الصعيد الوطني. موقع كارولينا الشمالية في الولايات المتحدة قيد الإنشاء حاليًا، مما يزيد من انتشاره العالمي. قامت شركة Hillgene ببناء مسار سريع لتطوير منتجات العلاج الخلوي، بدءًا من الاكتشاف وحتى التسليم، مع منصات لتصنيع الحمض النووي، وزراعة المصل-التعليق الحر، وتطوير العمليات المغلقة، واختبار مراقبة الجودة. تم تصميم منتجات BlueKit لمراقبة الجودة، وضمان نجاح ابتكارات العلاج الخلوي.
وقت النشر: 2024-09-05 14:47:03
