Kit zur Erkennung von K562-Feederzellenrückständen
Kit zur Erkennung von K562-Feederzellenrückständen
✓Ultra-Sensitive Detektion: Erkennt verbleibende K562-Feeder-Zellen in Konzentrationen von nur 0,05 % (10 Kopien/μL) und gewährleistet so die Einhaltung der FDA-Richtlinien für die Sicherheit von Zelltherapien.
✓RT-PCR-basierte Spezifität: Verwendet optimierte Primer/Sonden, die über RT-PCR auf K562-spezifische Sequenzen abzielen und gemäß den gesetzlichen Anforderungen auf Spezifität, Genauigkeit und Präzision validiert sind.
✓Großer Dynamikbereich: Linearer Erkennungsbereich von 10–1×106Kopien/μL, deckt Spurenreste bis hin zu hochkonzentrierten Proben ohne Verdünnung ab.
Dieses Kit nutzt RT-PCR mit speziell entwickelten Zielstellen für den Nachweis restlicher K562-Feederzellen. Mittels Genbearbeitung hergestellte K562-Zellen werden umfassend untersucht und aufgrund ihrer hervorragenden proliferativen Eigenschaften eingesetzt. Untersuchungen haben gezeigt, dass die Verwendung geneditierter K562-Zellen als Feederzellen die Effizienz der NK-Zellexpansion um das Zehn- bis Zehntausendfache steigern kann. Obwohl K562-Zellen bestrahlt und leicht von NK-Zellen eliminiert werden, ist es wichtig sicherzustellen, dass die restlichen Feeder-Zellen im Endprodukt minimiert werden, um die Patientensicherheit zu gewährleisten.
Allgemeiner Arbeitsablauf
1.Vorbereitung
Kit-Komponenten: Alle Reagenzien (außer Primer/Sonden) bei 4 °C auftauen, dann vortexen und kurz zentrifugieren (6000 U/min, 5 Sek.).
Sicherheit: Tragen Sie PSA (Laborkittel, Handschuhe, Maske) und arbeiten Sie in einem sauberen Bereich, um Kontaminationen zu vermeiden.
Ausrüstungsaufbau:
Stellen Sie sicher, dass das qPCR-Gerät (z. B. ABI 7500, Bio-Rad CFX96) mit FAM/VIC-Kanälen kalibriert ist.
Bereiten Sie RNA-Extraktions- und Reverse-Transkriptionsreagenzien vor.
2. Probenvorbehandlung
RNA-Extraktion:
Isolieren Sie Gesamt-RNA aus 1×106–5×106Zellen mithilfe eines kommerziellen RNA-Extraktionskits.
Reverse Transkription:
Wandeln Sie RNA mithilfe von gDNA-Entfernung und RT-Reagenzien (nicht im Kit enthalten) in cDNA um.
3. Vorbereitung des PCR-Reaktionsgemisches
Standardkurvenverdünnung:
Verdünnen Sie den quantitativen Standard K562 seriell (1×10).8Kopien/μL) mit DNA-Verdünnungsmittel, um 6 Punkte zu erzeugen (10–1×106Kopien/μL).
Beispiel:
Master-Mix-Zusammenstellung (pro Reaktion):
*Lassen Sie ROX weg, wenn das Gerät es nicht benötigt (z. B. Roche LightCycler).
Plattenaufbau:
Laden Sie 15 μL Master Mix + 5 μL Probe/Standard pro Vertiefung (Dreifachexemplare für Standards/Proben). Fügen Sie NTC (DNA-Verdünnungsmittel) hinzu.
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