L'isolamento del DNA da E. coli è una procedura fondamentale nella biologia molecolare. Questo articolo ti guiderà attraverso l'intero processo, fornendo passaggi e spiegazioni dettagliate, assicurandoti sia la scienza che gli aspetti pratici della procedura. Che tu sia un ricercatore esperto o un nuovo arrivato in laboratorio, questa guida sarà una risorsa preziosa.
Preparazione della sospensione cellulare
● Raccolta di cellule E. coli
Il primo passo nell'isolamento del DNA da E. coli prevede la raccolta delle cellule batteriche. Questo di solito richiede la coltivazione di E. coli in un mezzo liquido adatto fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica. I tempi sono cruciali perché le cellule in questa fase sono più praticabili e più facili da lisare, il che comporterà una maggiore resa del DNA.
● celle risospedenti in un tampone appropriato
Le cellule raccolte vengono quindi risospese in un tampone adatto. Una scelta comune è un tampone Tris - EDTA (TE), che aiuta a mantenere l'integrità del DNA durante il processo di estrazione. Il tampone ha molteplici scopi: stabilizza il pH, chelati i cationi bivalenti che potrebbero altrimenti degradare il DNA e fornire un ambiente ionico ottimale per le successive reazioni enzimatiche.
Centrifugazione alle cellule a pellet
● Parametri per la centrifugazione (velocità e tempo)
Dopo aver risospeso le cellule, la sospensione è sottoposta a centrifugazione per pellet delle cellule. La velocità e il tempo della centrifugazione sono parametri critici. In genere, la centrifugazione viene eseguita a circa 4.000 - 6.000 g per 10 - 15 minuti a 4 ° C. Ciò garantisce che le cellule formino un pellet stretto nella parte inferiore della tuba di centrifuga.
● Importanza del corretto pelleting
Il corretto pellet è essenziale per separare le cellule dal mezzo di crescita e altri componenti solubili. Un pellet ben - formato rende i passaggi successivi più facili ed efficienti, garantendo una perdita minima di cellule e, quindi, la massima resa del DNA.
Rimozione del surnatante
● Tecniche per la rimozione del surnatante
Una volta che le cellule sono pellettette, il surnatante (il liquido sopra il pellet) deve essere rimosso con cura senza disturbare il pellet cellulare. Questo di solito viene fatto usando una micropipetta. È fondamentale eseguire meticolosamente questo passo per evitare di perdere qualsiasi cellula.
● Garantire una perdita minima di pellet cellulare
Garantire una perdita minima del pellet cellulare comporta un'attenta pipa e, se necessario, più round di centrifugazione e rimozione del surnatante. L'obiettivo è mantenere quante più cellule possibili nel pellet per il massimo recupero del DNA.
Aggiunta di soluzione di lisi nuclei
● Componenti della soluzione di lisi nuclei
La soluzione di lisi nuclei in genere contiene un detergente (come SDS), un tampone (come Tris - HCl) e un agente chelante (come EDTA). Il detergente interrompe la membrana cellulare e l'involucro nucleare, rilasciando il contenuto cellulare, incluso il DNA, nella soluzione.
● Ruolo nel rompere le pareti cellulari
La soluzione di lisi nuclei non solo lisa la membrana cellulare, ma denaturalizza anche proteine e lipidi, abbattendo efficacemente le pareti cellulari e le buste nucleari per rilasciare il DNA nella soluzione.
Risospensione delle cellule
● Pipetting delicato per evitare il taglio del DNA
Una volta aggiunta la soluzione di lisi nuclei, le cellule devono essere risospese delicatamente per evitare il taglio del DNA. Il taglio può rompere il DNA in frammenti più piccoli, che possono essere problematici per le applicazioni a valle che richiedono DNA elevato - molecolare - peso.
● Garantire una risospensione completa
La risospensione completa garantisce che tutte le cellule siano lisate uniformemente, massimizzando il recupero del DNA. Ciò può essere ottenuto mediante una leggera pipa o vortice la soluzione a bassa velocità.
Incubazione alle cellule lisse
● Impostazioni di temperatura per l'incubazione
Le cellule risospese sono incubate a una temperatura specifica per garantire una lisi completa. Questo di solito viene fatto a 37 ° C a 55 ° C. La temperatura e la durata esatte possono variare a seconda del protocollo e dei requisiti specifici del kit di isolamento del DNA in uso.
● Durata richiesta per una lisi efficace
La durata tipica per l'incubazione è compresa tra 20 e 30 minuti, ma può essere regolata in base all'efficienza della lisi cellulare osservata. L'incubazione prolungata può essere necessaria per la lisi completa, ma dovrebbe essere bilanciata rispetto al rischio di degradazione del DNA.
Raffreddamento a temperatura ambiente
● Importanza del raffreddamento graduale
Dopo l'incubazione, il lisato viene gradualmente raffreddato a temperatura ambiente. Il raffreddamento graduale aiuta a stabilizzare il DNA e minimizza il rischio di shock termico, che potrebbe potenzialmente degradare il DNA.
● Effetti sul DNA e sui detriti cellulari
Il raffreddamento a temperatura ambiente consente ai detriti cellulari di precipitare, rendendo più facile separare il DNA nei passaggi successivi. Ciò aiuta anche a stabilizzare le attività enzimatiche e facilita la rimozione dell'RNA mediante il trattamento RNase.
Aggiunta di soluzione RNase
● Scopo di RNase nella procedura
La soluzione RNase viene aggiunta per degradare l'RNA, che altrimenti potrebbe co - purificare con il DNA e interferire con le applicazioni a valle. RNase digerisce selettivamente l'RNA, lasciando intatto il DNA.
● Prevenzione della contaminazione dell'RNA
Prevenire la contaminazione da RNA è cruciale per applicazioni che richiedono DNA puro, come PCR e sequenziamento. Il trattamento RNase garantisce che il DNA isolato sia privo di contaminanti dell'RNA.
Purificazione del DNA
● Metodi per separare il DNA da altri componenti cellulari
Diversi metodi possono essere utilizzati per purificare il DNA dal lisato. Questi includono l'estrazione del fenolo - cloroformio, precipitazione di etanolo e utilizzo di kit di DNA di E. coli commerciali. Ogni metodo ha i suoi pro e contro, con kit commerciali che offrono comodità e risultati coerenti.
● Considerazioni per la purezza del DNA
La purezza è un fattore critico per il successo delle applicazioni a valle. I kit commerciali, come il kit di DNA di E. coli di terapia cellulare, sono progettati per produrre DNA ad alta purezza rimuovendo efficacemente proteine, lipidi e altri contaminanti.
Conservazione e gestione del DNA isolato
● Best practice per la conservazione del DNA
Una volta purificato, il DNA deve essere conservato in un tampone adatto, come il tampone TE, a - 20 ° C o - 80 ° C per la conservazione a lungo termine. Evita il congelamento frequente - Cicli di scongelamento in quanto possono causare degradazione del DNA.
● Mantenimento dell'integrità del DNA per le applicazioni a valle
Per mantenere l'integrità del DNA, utilizzare sterili, nucleasi - tubi e soluzioni gratuite. Ciò garantisce che il DNA rimanga incontaminato e adatto a applicazioni come clonazione, sequenziamento e PCR.
DiBluekit
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Tempo post: 2024 - 09 - 05 14:47:03
