Isolar o DNA de E. coli é um procedimento fundamental na biologia molecular. Este artigo o levará a todo o processo, fornecendo etapas e explicações detalhadas, garantindo que você entenda a ciência e os aspectos práticos do procedimento. Seja você um pesquisador experiente ou um recém -chegado do laboratório, este guia será um recurso valioso.
Preparação da suspensão celular
● Coleção de células E. coli
A primeira etapa para isolar o DNA de E. coli envolve a coleta das células bacterianas. Isso geralmente requer o cultivo de E. coli em um meio líquido adequado até atingir a fase de crescimento logarítmico. O tempo é crucial porque as células nessa fase são mais viáveis e mais fáceis de lidera, o que resultará em maior rendimento de DNA.
● Células ressuspensas em um buffer apropriado
As células coletadas são então ressuspensas em um tampão adequado. Uma escolha comum é um tampão Tris - edta (TE), que ajuda a manter a integridade do DNA durante o processo de extração. O tampão serve a vários propósitos: estabiliza o pH, quelata cátions divalentes que, de outra forma, poderiam degradar o DNA e fornece um ambiente iônico ideal para reações enzimáticas subsequentes.
Centrifugação para células de pellets
● Parâmetros para centrifugação (velocidade e tempo)
Após ressuspensão das células, a suspensão é submetida a centrifugação para gritar as células. A velocidade e o tempo de centrifugação são parâmetros críticos. Normalmente, a centrifugação é realizada em cerca de 4.000 - 6.000 g por 10 - 15 minutos a 4 ° C. Isso garante que as células formem um grânulo apertado na parte inferior do tubo de centrífuga.
● Importância de granulação adequada
A portas adequadas é essencial para separar as células do meio de crescimento e outros componentes solúveis. Um bellet bem formado torna as etapas subsequentes mais fáceis e eficientes, garantindo a perda mínima de células e, portanto, o rendimento máximo de DNA.
Remoção de sobrenadante
● Técnicas para remoção de sobrenadante
Uma vez que as células são sedidas, o sobrenadante (o líquido acima do sedimento) deve ser cuidadosamente removido sem perturbar o sedimento da célula. Isso geralmente é feito usando uma micropipeta. É crucial executar esta etapa meticulosamente para evitar a perda de células.
● Garantir a perda mínima de pellets celular
Garantir a perda mínima do sedimento celular envolve pipetagem cuidadosa e, se necessário, várias rodadas de centrifugação e remoção sobrenadante. O objetivo é manter o maior número possível de células no sedimento para recuperação máxima de DNA.
Adição de solução de lise nuclea
● Componentes da solução de lise de núcleos
A solução de lise nucleosa normalmente contém um detergente (como SDS), um buffer (como Tris - HCl) e um agente quelante (como o EDTA). O detergente interrompe a membrana celular e o envelope nuclear, liberando o conteúdo celular, incluindo o DNA, na solução.
● Papel na quebra de paredes celulares
A solução de lise nucleosa não apenas lyes na membrana celular, mas também desnaturiza proteínas e lipídios, quebrando efetivamente as paredes celulares e os envelopes nucleares para liberar o DNA na solução.
Resuspressão das células
● pipetagem suave para evitar o cisalhamento do DNA
Uma vez adicionado a solução de lise nucleosa, as células precisam ser ressuspensas suavemente para evitar o cisalhamento do DNA. O cisalhamento pode dividir o DNA em fragmentos menores, o que pode ser problemático para aplicações a jusante que requerem DNA alto - molecular - peso.
● Garantir a ressuspensão completa
A ressuspensão completa garante que todas as células sejam lisadas uniformemente, maximizando a recuperação do DNA. Isso pode ser alcançado por pipetagem suave ou vórtex a solução a uma velocidade baixa.
Incubação para células lisáticas
● Configurações de temperatura para incubação
As células ressuspensas são incubadas a uma temperatura específica para garantir a lise completa. Isso geralmente é feito a 37 ° C a 55 ° C. A temperatura e a duração exatas podem variar dependendo do protocolo e dos requisitos específicos do kit de isolamento de DNA que está sendo usado.
● Duração necessária para a lise eficaz
A duração típica para incubação é entre 20 a 30 minutos, mas pode ser ajustada com base na eficiência da lise celular observada. A incubação prolongada pode ser necessária para a lise completa, mas deve ser equilibrada contra o risco de degradação do DNA.
Resfriamento para a temperatura ambiente
● Importância do resfriamento gradual
Após a incubação, o lisado é gradualmente resfriado à temperatura ambiente. O resfriamento gradual ajuda a estabilizar o DNA e minimiza o risco de choque térmico, o que pode potencialmente degradar o DNA.
● Efeitos no DNA e detritos celulares
O resfriamento na temperatura ambiente permite que os detritos celulares precipitem, facilitando a separação do DNA nas etapas subsequentes. Isso também ajuda a estabilizar as atividades da enzima e facilita a remoção do RNA pelo tratamento com RNase.
Adição de solução RNase
● Objetivo da RNase no procedimento
A solução de RNase é adicionada ao degradar RNA, que, de outra forma, poderia co - purificar com o DNA e interferir nos aplicativos a jusante. RNase digere seletivamente o RNA, deixando o DNA intacto.
● Prevenção da contaminação do RNA
A prevenção de contaminação por RNA é crucial para aplicações que requerem DNA puro, como PCR e sequenciamento. O tratamento com RNase garante que o DNA isolado esteja livre de contaminantes de RNA.
Purificação do DNA
● Métodos para separar o DNA de outros componentes celulares
Vários métodos podem ser usados para purificar o DNA do lisado. Isso inclui extração de fenol - clorofórmio, precipitação de etanol e kits comerciais de DNA de E. coli. Cada método possui seus prós e contras, com kits comerciais oferecendo conveniência e resultados consistentes.
● Considerações para a pureza do DNA
A pureza é um fator crítico para o sucesso das aplicações a jusante. Os kits comerciais, como o kit de DNA de E. coli da terapia celular, são projetados para produzir DNA de alta pureza, removendo efetivamente proteínas, lipídios e outros contaminantes.
Armazenamento e manuseio de DNA isolado
● Melhores práticas para armazenar DNA
Uma vez purificado, o DNA deve ser armazenado em um tampão adequado, como o tampão TE, a - 20 ° C ou - 80 ° C para armazenamento longo - Evite congelamento frequente - ciclos de degelo, pois eles podem causar degradação do DNA.
● Manter a integridade do DNA para aplicações a jusante
Para manter a integridade do DNA, use tubos e soluções estéril e nuclease - Isso garante que o DNA permaneça não contaminado e adequado para aplicações como clonagem, seqüenciamento e PCR.
SobreBluekit
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Hora da postagem: 2024 - 09 - 05 14:47:03
