Das Isolieren von DNA aus E. coli ist ein grundlegendes Verfahren in der molekularen Biologie. Dieser Artikel führt Sie durch den gesamten Prozess und liefert detaillierte Schritte und Erklärungen, um sicherzustellen, dass Sie sowohl die Wissenschaft als auch die praktischen Aspekte des Verfahrens verstehen. Egal, ob Sie ein erfahrener Forscher oder ein Neuling im Labor sind, dieser Leitfaden wird eine wertvolle Ressource sein.
Herstellung der Zellsuspension
● Sammlung von E. coli -Zellen
Der erste Schritt bei der Isolierung von DNA von E. coli besteht darin, die Bakterienzellen zu sammeln. Dies erfordert normalerweise das Anbau von E. coli in einem geeigneten flüssigen Medium, bis es die logarithmische Wachstumsphase erreicht. Das Timing ist entscheidend, da die Zellen in dieser Phase am lebensfähigsten und leichter zu lyse sind, was zu einer höheren DNA -Ausbeute führt.
● Zellen in einem geeigneten Puffer resuspendieren
Gesammelte Zellen werden dann in einem geeigneten Puffer resuspendiert. Eine gemeinsame Wahl ist ein TRIS - EDTA (TE) -Puffer, mit dem die Integrität der DNA während des Extraktionsprozesses aufrechterhalten wird. Der Puffer dient mehreren Zwecken: Er stabilisiert den pH -Wert, chelziert zweifeste Kationen, die die DNA ansonsten abbauen könnten, und liefert eine optimale ionische Umgebung für nachfolgende enzymatische Reaktionen.
Zentrifugation an Pelletzellen
● Parameter für die Zentrifugation (Geschwindigkeit und Zeit)
Nach der Resuspendierung der Zellen wird die Suspension einer Zentrifugation ausgesetzt, um die Zellen zu pellet. Zentrifugationsgeschwindigkeit und Zeit sind kritische Parameter. Typischerweise wird die Zentrifugation bei rund 4.000 - 6.000 g für 10 - 15 Minuten bei 4 ° C durchgeführt. Dies stellt sicher, dass die Zellen am Boden des Zentrifugenröhrchens ein enges Pellet bilden.
● Bedeutung des ordnungsgemäßen Pelletings
Das richtige Pelleting ist wichtig, um die Zellen vom Wachstumsmedium und anderen löslichen Komponenten zu trennen. Ein Brunnenpellet erleichtert die nachfolgenden Schritte einfacher und effizienter, wodurch ein minimaler Verlust der Zellen und damit die maximale DNA -Ausbeute sichergestellt wird.
Entfernung des Überstands
● Techniken zur Entfernung des Überstands
Sobald die Zellen pelletiert sind, muss der Überstand (die Flüssigkeit über dem Pellet) vorsichtig entfernt werden, ohne das Zellpellet zu stören. Dies geschieht normalerweise mit einer Mikropipette. Es ist entscheidend, diesen Schritt akribisch durchzuführen, um zu vermeiden, dass Zellen verloren gehen.
● Gewährleistung eines minimalen Verlusts an Zellpellet
Durch die Gewährleistung eines minimalen Verlustes des Zellpellets beinhaltet eine sorgfältige Pipette und bei Bedarf mehrere Runden der Zentrifugation und Überstandentfernung. Ziel ist es, so viele Zellen wie möglich im Pellet für maximale DNA -Erholung zu halten.
Zugabe von Kernlösungen
● Komponenten der Kernlyse -Lösung
Die Kernlyse -Lösung enthält typischerweise ein Reinigungsmittel (wie SDS), einen Puffer (wie Tris - HCl) und ein Chelatmittel (wie EDTA). Das Reinigungsmittel stört die Zellmembran und die Kernhülle und setzt den zellulären Gehalt, einschließlich DNA, in die Lösung.
● Rolle beim Abbau der Zellwände
Die Kernlyse -Lösung lysiert nicht nur die Zellmembran, sondern denaturisiert auch Proteine und Lipide, wodurch die Zellwände und Kernumschläge effektiv abgebaut werden, um DNA in die Lösung zu füllen.
Resuspension von Zellen
● Scharfe Pipettierung, um DNA -Scherung zu vermeiden
Sobald die Nuklei -Lyse -Lösung zugegeben ist, müssen die Zellen sanft resuspendiert werden, um DNA -Scheren zu vermeiden. Das Scheren kann die DNA in kleinere Fragmente unterteilen, was für nachgeschaltete Anwendungen, die eine hohe - molekulare - Gewichts -DNA erfordern, problematisch sein können.
● Gewährleistung einer vollständigen Resuspension
Eine vollständige Resuspension stellt sicher, dass alle Zellen gleichmäßig lysiert werden und die DNA -Wiederherstellung maximieren. Dies kann durch sanftes Pipettieren oder Vorbild der Lösung mit niedriger Geschwindigkeit erreicht werden.
Inkubation zu Lyse -Zellen
● Temperatureinstellungen für die Inkubation
Die resuspendierten Zellen werden bei einer bestimmten Temperatur inkubiert, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten. Dies geschieht normalerweise bei 37 ° C bis 55 ° C. Die genaue Temperatur und Dauer kann je nach Protokoll und den spezifischen Anforderungen des verwendeten DNA -Isolierungskits variieren.
● Dauer, die für eine effektive Lyse erforderlich ist
Die typische Dauer für die Inkubation liegt zwischen 20 und 30 Minuten, kann jedoch auf der Grundlage der Effizienz der beobachteten Zelllyse eingestellt werden. Für die vollständige Lyse kann eine längere Inkubation erforderlich sein, sollte jedoch gegen das Risiko eines DNA -Abbaus ausgeglichen werden.
Kühlung auf Raumtemperatur
● Bedeutung der allmählichen Kühlung
Nach der Inkubation wird das Lysat allmählich auf Raumtemperatur abgekühlt. Die allmähliche Kühlung hilft bei der Stabilisierung der DNA und minimiert das Risiko eines thermischen Schocks, was möglicherweise die DNA abbauen könnte.
● Auswirkungen auf DNA und Zelltrümmer
Durch das Abkühlen bis zur Raumtemperatur können die Zelltrümmer ausfällt, was es einfacher macht, die DNA in den nachfolgenden Schritten zu trennen. Dies hilft auch, die Enzymaktivitäten zu stabilisieren und die Entfernung von RNA durch RNase -Behandlung zu erleichtern.
Zugabe von RNase -Lösung
● Zweck der RNase im Verfahren
Die RNase -Lösung wird hinzugefügt, um die RNA abzubauen, die ansonsten mit der DNA purifizieren und die nachgeschalteten Anwendungen beeinträchtigen könnten. RNase verdaut selektiv die RNA und lässt die DNA intakt.
● Verhinderung der RNA -Kontamination
Die Verhinderung der RNA -Kontamination ist für Anwendungen von entscheidender Bedeutung, für die reine DNA wie PCR und Sequenzierung erforderlich sind. Die RNase -Behandlung stellt sicher, dass die isolierte DNA frei von RNA -Verunreinigungen ist.
Reinigung der DNA
● Methoden zur Trennung von DNA von anderen zellulären Komponenten
Verschiedene Methoden können verwendet werden, um DNA aus dem Lysat zu reinigen. Dazu gehören Phenol - Chloroform -Extraktion, Ethanolniederschlag und unter Verwendung kommerzieller E. coli -DNA -Kits. Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile, wobei kommerzielle Kits Bequemlichkeit und konsistente Ergebnisse bieten.
● Überlegungen zur DNA -Reinheit
Reinheit ist ein kritischer Faktor für den Erfolg von nachgelagerten Anwendungen. Kommerzielle Kits wie das Zelltherapie E. coli DNA -Kit sind so ausgelegt, dass sie eine hohe - Reinheit DNA ergeben, indem Proteine, Lipide und andere Verunreinigungen effektiv entfernt werden.
Lagerung und Handhabung von isolierter DNA
● Best Practices für die Speicherung von DNA
Nach der Reinigung sollte die DNA in einem geeigneten Puffer wie dem TE -Puffer bei - 20 ° C oder - 80 ° C für eine lange Lagerspeicherung gespeichert werden. Vermeiden Sie häufige Einfrieren auf Tauzzyklen, da sie einen DNA -Abbau verursachen können.
● Aufrechterhaltung der DNA -Integrität für nachgelagerte Anwendungen
Verwenden Sie zur Aufrechterhaltung der DNA -Integrität sterile, nuklease - freie Röhrchen und Lösungen. Dies stellt sicher, dass die DNA nicht kontaminiert und für Anwendungen wie Klonierung, Sequenzierung und PCR geeignet bleibt.
UmBluekit
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Postzeit: 2024 - 09 - 05 14:47:03
