عزل الحمض النووي من E. coli هو إجراء أساسي في البيولوجيا الجزيئية. سوف تسير هذه المقالة خلال العملية بأكملها ، مما يوفر خطوات وتفسيرات مفصلة ، مما يضمن لك فهم كل من العلم والجوانب العملية للإجراء. سواء كنت باحثًا محنكًا أو قادمًا جديدًا للمختبر ، سيكون هذا الدليل موردًا قيماً.
إعداد تعليق الخلايا
● مجموعة من خلايا E. coli
الخطوة الأولى في عزل الحمض النووي من E. coli تنطوي على جمع الخلايا البكتيرية. يتطلب هذا عادةً نمو E. coli في وسيلة سائلة مناسبة حتى يصل إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي. يعد التوقيت أمرًا بالغ الأهمية لأن الخلايا في هذه المرحلة هي الأكثر قابلية للتطبيق وأسهل في LYSE ، مما سيؤدي إلى ارتفاع محصول الحمض النووي.
● إعادة توليد الخلايا في المخزن المؤقت المناسب
ثم يتم تعليق الخلايا التي تم جمعها في مخزن مؤقت مناسب. الخيار المشترك هو عازلة Tris - EDTA (TE) ، والتي تساعد على الحفاظ على سلامة الحمض النووي أثناء عملية الاستخراج. يخدم المخزن المؤقت أغراض متعددة: إنه يستقر الرقم الهيدروجيني ، ويخلع الكاتيونات الثنائية التي يمكن أن تحلل الحمض النووي ، وتوفر بيئة أيونية مثالية للتفاعلات الأنزيمية اللاحقة.
الطرد المركزي لخلايا بيليه
● معلمات لطرد مركزي (السرعة والوقت)
بعد إعادة تشكيل الخلايا ، يتعرض التعليق لطرد مركزي لحيوية الخلايا. سرعة الطرد المركزي والوقت هي معلمات مهمة. عادة ، يتم إجراء الطرد المركزي عند حوالي 4000 - 6000 جم لمدة 10 - 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. هذا يضمن أن الخلايا تشكل بيليه ضيق في أسفل أنبوب الطرد المركزي.
● أهمية الحبيبات السليمة
تعتبر الكبيحة المناسبة ضرورية لفصل الخلايا عن وسط النمو والمكونات القابلة للذوبان الأخرى. البئر - بيليه تشكلت الخطوات اللاحقة أسهل وأكثر كفاءة ، مما يضمن الحد الأدنى من فقدان الخلايا ، وبالتالي ، أقصى محصول الحمض النووي.
إزالة طاف
● تقنيات إزالة طاف
بمجرد أن يتم تكوير الخلايا ، يجب إزالة طاف (السائل فوق الحبيبة) بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. عادة ما يتم ذلك باستخدام micropipette. من الأهمية بمكان إجراء هذه الخطوة بدقة لتجنب فقدان أي خلايا.
● ضمان الحد الأدنى من فقدان بيليه الخلايا
يتضمن ضمان الحد الأدنى من فقدان بيليه الخلايا أنابيب دقيقة ، وإذا لزم الأمر ، جولات متعددة من الطرد المركزي وإزالة طاف. الهدف من ذلك هو الحفاظ على أكبر عدد ممكن من الخلايا في بيليه لتحقيق أقصى قدر من استرداد الحمض النووي.
إضافة محلول تحلل النوى
● مكونات محلول تحلل النوى
يحتوي محلول تحلل النواة عادةً على منظف (مثل SDS) ، ومخزن مؤقت (مثل Tris - HCl) ، وعامل مخلب (مثل EDTA). يعطل المنظف غشاء الخلية والمغلف النووي ، ويطلق المحتويات الخلوية ، بما في ذلك الحمض النووي ، في المحلول.
● دور في تحطيم جدران الخلايا
لا يقتصر محلول تحلل النواة على غشاء الخلية فحسب ، بل يشرب أيضًا من البروتينات والدهون ، مما يؤدي بشكل فعال إلى تحطيم جدران الخلايا والأظرف النووية لإطلاق الحمض النووي في المحلول.
إعادة توسيع الخلايا
● الأنابيب اللطيفة لتجنب قص الحمض النووي
بمجرد إضافة محلول تحلل النوى ، يجب إعادة تعليق الخلايا بلطف لتجنب قص الحمض النووي. يمكن للقص أن يكسر الحمض النووي إلى شظايا أصغر ، والتي يمكن أن تكون مشكلة في تطبيقات المصب التي تتطلب ارتفاعًا عاليًا - الحمض النووي للوزن.
● ضمان التعادل الكامل
يضمن إعادة التقاعد الكامل أن يتم وضع جميع الخلايا بشكل موحد ، مما يزيد من استعادة الحمض النووي. يمكن تحقيق ذلك عن طريق الأنابيب اللطيفة أو دوامة الحل بسرعة منخفضة.
الحضانة لخلايا LYSE
● إعدادات درجة الحرارة للحضانة
يتم تحضين الخلايا المعلقة في درجة حرارة محددة لضمان تحلل كامل. يتم ذلك عادة عند 37 درجة مئوية إلى 55 درجة مئوية. يمكن أن تختلف درجة الحرارة والمدة الدقيقة حسب البروتوكول والمتطلبات المحددة لمجموعة عزل الحمض النووي المستخدمة.
● المدة المطلوبة للتحلل الفعال
تتراوح المدة النموذجية للحضانة بين 20 إلى 30 دقيقة ، ولكن يمكن تعديلها بناءً على كفاءة تحلل الخلية. قد يكون الحضانة المطولة ضرورية للتحلل التام ولكن يجب موازنة مع خطر تدهور الحمض النووي.
التبريد إلى درجة حرارة الغرفة
● أهمية التبريد التدريجي
بعد الحضانة ، يتم تبريد المحللة تدريجياً إلى درجة حرارة الغرفة. يساعد التبريد التدريجي في تثبيت الحمض النووي ويقلل من خطر الصدمة الحرارية ، مما قد يؤدي إلى تدهور الحمض النووي.
● الآثار على الحمض النووي والحطام الخلوي
يتيح التبريد إلى درجة حرارة الغرفة أن يترسب الحطام الخلوي ، مما يسهل فصل الحمض النووي في الخطوات اللاحقة. هذا يساعد أيضًا على تثبيت أنشطة الإنزيم ويسهل إزالة الحمض النووي الريبي عن طريق علاج RNase.
إضافة حل RNase
● الغرض من RNase في الإجراء
تتم إضافة محلول RNase لتخفيض الحمض النووي الريبي ، والذي يمكن أن يتنفي مع الحمض النووي ويتداخل مع تطبيقات المصب. RNase هضم بشكل انتقائي الحمض النووي الريبي ، وترك الحمض النووي سليمة.
● منع تلوث الحمض النووي الريبي
يعد منع تلوث الحمض النووي الريبي أمرًا ضروريًا للتطبيقات التي تتطلب الحمض النووي النقي ، مثل PCR والتسلسل. يضمن علاج RNase أن الحمض النووي المعزول خالي من ملوثات الحمض النووي الريبي.
تنقية الحمض النووي
● طرق فصل الحمض النووي عن المكونات الخلوية الأخرى
يمكن استخدام عدة طرق لتنقية الحمض النووي من المحللة. وتشمل هذه الفينول - استخراج الكلوروفورم ، هطول الأمطار الإيثانول ، واستخدام مجموعات الحمض النووي E. coli التجارية. كل طريقة لها إيجابيات وسلبياتها ، مع مجموعات تجارية تقدم الراحة والنتائج المتسقة.
● اعتبارات نقاء الحمض النووي
النقاء هو عامل حاسم لنجاح التطبيقات المصب. تم تصميم مجموعات تجارية ، مثل Therapy Therapy E. Coli DNA ، لإعطاء الحمض النووي المرتفع - النقاء عن طريق إزالة البروتينات والدهون وغيرها من الملوثات بشكل فعال.
تخزين ومعالجة الحمض النووي المعزول
● أفضل الممارسات لتخزين الحمض النووي
بمجرد تنقية ، يجب تخزين الحمض النووي في مخزن مؤقت مناسب ، مثل المخزن المؤقت TE ، في - 20 درجة مئوية أو - 80 درجة مئوية لفترة طويلة - تخزين مصطلح. تجنب التجميد المتكرر - دورات ذوبان الجليد لأنها يمكن أن تسبب تدهور الحمض النووي.
● الحفاظ على سلامة الحمض النووي لتطبيقات المصب
للحفاظ على سلامة الحمض النووي ، استخدم معقمة ، نوكلياز - أنابيب وحلول مجانية. هذا يضمن أن الحمض النووي لا يزال غير ملوّرة ومناسبة للتطبيقات مثل الاستنساخ والتسلسل و PCR.
عنBluekit
أنشأت Jiangsu Hillgene مقرها الرئيسي (10،000㎡ GMP Plants and R&D Center) في Suzhou ، الواقعة في منطقة Wuzhong ، Suzhou ، وهي مدينة في بحيرة Taihu الجميلة ، ومواقع تصنيع في شنتشن وشنغهاي ، تمتد على شبكة التصنيع. موقع ولاية كارولينا الشمالية في الولايات المتحدة قيد الإنشاء حاليًا ، مما يزيد من وجوده العالمي. قامت Hillgene ببناء مسار صريح لتطوير منتجات العلاج الخلوي ، من الاكتشاف إلى التسليم ، مع منصات لتصنيع الأحماض النووية ، المصل - زراعة التعليق المجاني ، وتطوير العملية المغلقة ، واختبار مراقبة الجودة. تم تصميم منتجات Bluekit لمراقبة الجودة ، مما يضمن نجاح ابتكارات العلاج الخلوي.
وقت النشر: 2024 - 09 - 05 14:47:03
