Изоляция ДНК из E. coli является фундаментальной процедурой в молекулярной биологии. Эта статья проведет вас по всему процессу, предоставив подробные шаги и объяснения, гарантируя, что вы понимаете как науку, так и практические аспекты процедуры. Независимо от того, являетесь ли вы опытным исследователем или новичком в лаборатории, это руководство станет ценным ресурсом.
Подготовка клеточной суспензии
● Сбор клеток кишечной палочки
Первый шаг в изоляции ДНК из E. coli включает в себя сбор бактериальных клеток. Обычно это требует выращивания кишечной палочки в подходящей жидкой среде, пока не достигнет фазы логарифмического роста. Время имеет решающее значение, потому что клетки в этой фазе наиболее жизнеспособны и проще для лизирования, что приведет к более высоким выходу ДНК.
● Восстановление клеток в соответствующем буфере
Собранные клетки затем ресуспендируют в подходящем буфере. Общим выбором является буфер Tris - EDTA (TE), который помогает поддерживать целостность ДНК во время процесса экстракции. Буфер служит нескольким целям: он стабилизирует рН, хелатирует двухвалентные катионы, которые в противном случае могли бы ухудшить ДНК, и обеспечивает оптимальную ионную среду для последующих ферментативных реакций.
Центрифугирование к клеткам гранулы
● Параметры для центрифугирования (скорость и время)
После ресуспендирования клетки суспензия подвергается центрифугированию для осадки клеток. Скорость центрифугирования и время являются критическими параметрами. Как правило, центрифугирование выполняется со скоростью около 4000 - 6000 г в течение 10 - 15 минут при 4 ° C. Это гарантирует, что клетки образуют плотный осадок в нижней части центрифужной трубки.
● Важность правильной гранулирования
Правильное осадка имеет важное значение для отделения клеток от среды роста и других растворимых компонентов. Хорошо, образованный осадок, облегчает последующие шаги более простыми и эффективными, обеспечивая минимальную потерю клеток и, следовательно, максимальный выход ДНК.
Удаление супернатанта
● Методы удаления супернатанта
После того, как клетки осаждаются, супернатант (жидкость над гранулом) должен быть тщательно удален без нарушения клеточной осадка. Обычно это делается с помощью микропипетки. Крайне важно выполнить этот шаг, чтобы избежать потери каких -либо клеток.
● Обеспечение минимальной потери клеточного осадка
Обеспечение минимальной потери клеточного осадка включает в себя тщательный пипетирование и, при необходимости, несколько раундов центрифугирования и удаления супернатанта. Цель состоит в том, чтобы сохранить как можно больше клеток в осадке для максимального восстановления ДНК.
Добавление раствора лизиса ядер
● Компоненты раствора лизиса ядер
Раствор лизиса ядер обычно содержит моющее средство (например, SDS), буфер (такой как Tris - HCl) и хелатирующий агент (например, EDTA). Моющее средство нарушает клеточную мембрану и ядерную оболочку, высвобождая клеточное содержание, включая ДНК, в раствор.
● Роль в разрушении клеточных стен
Раствор лизиса ядер не только лизирует клеточную мембрану, но также денатуразирует белки и липиды, эффективно разбивая клеточные стенки и ядерные конверты для высвобождения ДНК в раствор.
Ресуспендирование клеток
● Нежная пипетирование, чтобы избежать сдвига ДНК
Как только раствор лизиса ядер добавляется, клетки необходимо осторожно ресуспендировать, чтобы избежать сдвига ДНК. Сдвиг может разбить ДНК на более мелкие фрагменты, что может быть проблематичным для применения в нижних направлениях, которые требуют высокого - молекулярного - веса ДНК.
● Обеспечение полного ресуспендирования
Полная ресуспендиация гарантирует, что все клетки лизируются равномерно, максимизируя восстановление ДНК. Это может быть достигнуто путем мягкого пипетирования или встряхивания раствора с низкой скоростью.
Инкубация в клетки лиза
● Настройки температуры для инкубации
Резуспендированные клетки инкубируются при определенной температуре, чтобы обеспечить полный лизис. Обычно это делается при 37 ° C до 55 ° C. Точная температура и продолжительность могут варьироваться в зависимости от протокола и конкретных требований используемого набора для выделения ДНК.
● Продолжительность, необходимая для эффективного лизиса
Типичная продолжительность инкубации составляет от 20 до 30 минут, но ее можно скорректировать на основе эффективности наблюдаемого лизиса клеток. Длительная инкубация может быть необходима для полного лизиса, но должна быть сбалансирована с риском деградации ДНК.
Охлаждение до комнатной температуры
● Важность постепенного охлаждения
После инкубации лизат постепенно охлаждается до комнатной температуры. Постепенное охлаждение помогает в стабилизации ДНК и минимизирует риск теплового шока, который потенциально может ухудшить ДНК.
● Влияние на ДНК и клеточный мусор
Охлаждение до комнатной температуры позволяет клеточному мусору осадить, что облегчает разделение ДНК на последующих этапах. Это также помогает стабилизировать активность фермента и облегчает удаление РНК обработкой РНКазы.
Добавление раствора РНКазы
● Цель РНКазы в процедуре
Раствор РНКазы добавляется для разложения РНК, что в противном случае может очистить с ДНК и мешать приложениям вниз по течению. РНКаза избирательно переваривает РНК, оставляя ДНК нетронутой.
● Предотвращение загрязнения РНК
Предотвращение загрязнения РНК имеет решающее значение для применений, которые требуют чистой ДНК, таких как ПЦР и секвенирование. Обработка РНКазы гарантирует, что изолированная ДНК свободна от загрязнения РНК.
Очищение ДНК
● Методы отделения ДНК от других клеточных компонентов
Несколько методов могут быть использованы для очистки ДНК из лизата. К ним относятся фенол - Хлороформная экстракция, осаждение этанола и использование коммерческих наборов ДНК E. coli. Каждый метод имеет свои плюсы и минусы, с коммерческими наборами, предлагающими удобство и последовательные результаты.
● Соглашения о чистоте ДНК
Чистота является критическим фактором для успеха нижестоящих приложений. Коммерческие наборы, такие как клеточная терапия E. coli ДНК, предназначены для получения ДНК с высокой чистотой путем эффективного удаления белков, липидов и других загрязнений.
Хранение и обработка изолированной ДНК
● Лучшие практики хранения ДНК
После очистки ДНК следует хранить в подходящем буфере, например, в буфере TE, при - 20 ° C или - 80 ° C для длительного - Избегайте частых циклов оттаивания, так как они могут вызвать деградацию ДНК.
● Поддержание целостности ДНК для приложений вниз по течению
Чтобы поддерживать целостность ДНК, используйте стерильную, нуклеазу - бесплатные трубки и решения. Это гарантирует, что ДНК остается незагрязненной и подходящей для таких приложений, как клонирование, секвенирование и ПЦР.
ОBluekit
Jiangsu Hillgene создал свою штаб -квартиру (10 000 ㎡ GMP за растения и центр исследований и разработок) в Сучжоу, расположенной в районе Учжун, Сучжоу, городе озера прекрасного озера Тайху, и двух производственных участков в Шэньчжене и Шанххае, расширяющих его сеть производства по всей стране. Участок в Северной Каролине в США в настоящее время строится, что еще больше распространяет свое глобальное присутствие. HillGene построил экспресс -путь для разработки продуктов клеточной терапии, от обнаружения до доставки, с платформами для производства нуклеиновых кислот, сыворотки - свободного культивирования подвески, разработки закрытого процесса и тестирования QC. Продукты Bluekit предназначены для контроля качества, обеспечивая успех инноваций клеточной терапии.
Время публикации: 2024 - 09 - 05 14:47:03
