大腸菌からDNAを分離することは、分子生物学の基本的な手順です。この記事では、プロセス全体を説明し、詳細な手順と説明を提供し、科学と手順の実用的な側面の両方を理解するようにします。あなたがベテランの研究者であろうとラボの新人であろうと、このガイドは貴重なリソースになります。
細胞懸濁液の準備
●大腸菌細胞の収集
大腸菌からDNAを分離する最初のステップには、細菌細胞の収集が含まれます。これには通常、対数成長段階に達するまで、適切な液体培地で大腸菌を栽培する必要があります。この段階の細胞は最も実行可能で溶解しやすいため、タイミングが重要です。これにより、DNA収量が高くなります。
●適切なバッファー内のセルを再懸濁します
収集された細胞は、適切なバッファーに再懸濁されます。一般的な選択は、抽出プロセス中にDNAの完全性を維持するのに役立つTris - Edta（TE）バッファーです。バッファーは複数の目的を果たします。それはpHを安定させ、それ以外の場合はDNAを分解する可能性のある二価カチオンをキレートし、その後の酵素反応に最適なイオン環境を提供します。
ペレット細胞への遠心分離
●遠心分離のパラメーター（速度と時間）
細胞を再懸濁した後、懸濁液は細胞をペレットするために遠心分離を受けます。遠心分離速度と時間は重要なパラメーターです。通常、遠心分離は、4°Cで10分間、約4,000 - 6,000 gで実行されます。これにより、細胞が遠心管の底部にタイトなペレットを形成することが保証されます。
●適切なペレットの重要性
適切なペレットは、細胞を成長媒体や他の可溶性成分から分離するために不可欠です。ウェル-形成されたペレットにより、後続のステップがより簡単かつ効率的になり、細胞の損失が最小限に抑えられ、したがって最大のDNA収率が確保されます。
上清の除去
●上清除去の手法
細胞がペレットされたら、細胞ペレットを乱すことなく上清（ペレットの上の液体）を慎重に除去する必要があります。これは通常、マイクロピペットを使用して行われます。細胞を失うことを避けるために、このステップを細心の注意を払って実行することが重要です。
●細胞ペレットの最小限の損失を保証します
細胞ペレットの最小限の損失を確保するには、慎重なピペッティングと、必要に応じて、複数回の遠心分離と上清除去が含まれます。目標は、最大のDNA回復のためにペレットにできるだけ多くの細胞を保持することです。
核溶解溶液の添加
●核溶解溶液の成分
核溶解溶液には、通常、洗剤（SDSなど）、バッファー（Tris - HClなど）、キレート剤（EDTAなど）が含まれています。洗剤は細胞膜と核エンベロープを破壊し、DNAを含む細胞の含有量を溶液に放出します。
●細胞壁を分解する際の役割
核溶解溶液は、細胞膜を溶解するだけでなく、タンパク質と脂質を変異させ、細胞壁と核封筒を効果的に分解してDNAを溶液に放出します。
細胞の再懸濁
●DNAせん断を避けるための穏やかなピペッティング
核溶解溶液が追加されると、DNAせん断を避けるために細胞を穏やかに再懸濁する必要があります。せん断は、DNAをより小さなフラグメントに分割する可能性があります。これは、高-分子-重量DNAを必要とする下流のアプリケーションでは問題になる可能性があります。
●完全な再懸濁を確保します
完全な再懸濁により、すべての細胞が均一に溶解し、DNA回復を最大化することが保証されます。これは、穏やかなピペッティングまたは低速で溶液を渦巻くことで実現できます。
細胞へのインキュベーション
●インキュベーションの温度設定
再懸濁した細胞は、完全な溶解を確保するために特定の温度でインキュベートされます。これは通常、37°Cから55°Cで行われます。正確な温度と期間は、プロトコルと使用されているDNA分離キットの特定の要件によって異なります。
●効果的な溶解に必要な期間
インキュベーションの典型的な期間は20〜30分ですが、観察された細胞溶解の効率に基づいて調整できます。完全な溶解には長時間のインキュベーションが必要になる場合がありますが、DNA分解のリスクとバランスをとる必要があります。
室温までの冷却
●漸進的な冷却の重要性
インキュベーション後、溶解物は徐々に室温まで冷却されます。漸進的な冷却は、DNAの安定化に役立ち、熱ショックのリスクを最小限に抑え、DNAを潜在的に分解する可能性があります。
●DNAおよび細胞の破片への影響
室温まで冷却すると、細胞の破片が沈殿することができ、その後のステップでDNAを分離しやすくなります。これはまた、酵素活性を安定化し、RNase処理によるRNAの除去を促進するのに役立ちます。
RNase溶液の添加
●手順におけるRNaseの目的
RNASE溶液を加えてRNAを分解します。RNAは、DNAと共存し、下流のアプリケーションを妨害する可能性があります。 RNaseはRNAを選択的に消化し、DNAをそのまま残します。
●RNA汚染の防止
RNA汚染を防ぐことは、PCRやシーケンスなどの純粋なDNAを必要とする用途にとって重要です。 RNase処理により、分離されたDNAにRNA汚染物質がないことが保証されます。
DNAの精製
●DNAを他の細胞成分から分離する方法
いくつかの方法を使用して、溶解物からDNAを精製することができます。これらには、フェノール-クロロホルム抽出、エタノール沈殿、および市販の大腸菌DNAキットの使用が含まれます。各方法には長所と短所があり、商用キットは利便性と一貫した結果を提供します。
●DNA純度に関する考慮事項
純度は、ダウンストリームアプリケーションの成功にとって重要な要素です。細胞療法E. coli DNAキットなどの市販のキットは、タンパク質、脂質、およびその他の汚染物質を効果的に除去することにより、高純度DNAを生成するように設計されています。
分離DNAの保管と取り扱い
●DNAを保存するためのベストプラクティス
精製したら、DNAは、長期保存で- 20°Cまたは- 80°CのTEバッファーなどの適切なバッファーに保存する必要があります。頻繁に凍結することは避けてください-解凍サイクルそれらはDNA分解を引き起こす可能性があるため。
●ダウンストリームアプリケーションのDNA完全性の維持
DNAの完全性を維持するには、滅菌、ヌクレアーゼ-遊離チューブと溶液を使用します。これにより、DNAは染色されていないままであり、クローニング、シーケンス、PCRなどのアプリケーションに適しています。
についてbluekit
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投稿時間：2024 - 09 - 05 14:47:03
