El ADN aislante de E. coli es un procedimiento fundamental en biología molecular. Este artículo lo guiará a través de todo el proceso, proporcionando pasos y explicaciones detalladas, asegurando que comprenda tanto la ciencia como los aspectos prácticos del procedimiento. Ya sea que sea un investigador experimentado o un recién llegado al laboratorio, esta guía será un recurso valioso.
Preparación de la suspensión celular
● Colección de células de E. coli
El primer paso para aislar el ADN de E. coli implica recolectar las células bacterianas. Esto generalmente requiere el crecimiento de E. coli en un medio líquido adecuado hasta que alcanza la fase de crecimiento logarítmico. El momento es crucial porque las células en esta fase son más viables y más fáciles de lanzar, lo que dará como resultado un mayor rendimiento de ADN.
● Resuspender las células en un tampón apropiado
Las células recogidas se resuspenden en un tampón adecuado. Una elección común es un tampón Tris - EDTA (TE), que ayuda a mantener la integridad del ADN durante el proceso de extracción. El tampón tiene múltiples propósitos: estabiliza el pH, quelata cationes divalentes que de otro modo podrían degradar el ADN y proporciona un entorno iónico óptimo para las reacciones enzimáticas posteriores.
Centrifugación a células de pellets
● Parámetros para la centrifugación (velocidad y tiempo)
Después de resuspender las células, la suspensión se somete a centrifugación para sedimentar las células. La velocidad y el tiempo de centrifugación son parámetros críticos. Típicamente, la centrifugación se realiza en alrededor de 4,000 - 6,000 g durante 10 - 15 minutos a 4 ° C. Esto asegura que las células formen un sedimento apretado en la parte inferior del tubo de centrífuga.
● Importancia de la pelleting adecuada
La sedimentación adecuada es esencial para separar las células del medio de crecimiento y otros componentes solubles. Un pellet bien formado hace que los pasos posteriores sean más fáciles y más eficientes, asegurando una pérdida mínima de células y, por lo tanto, el rendimiento máximo de ADN.
Eliminación de sobrenadante
● Técnicas para la eliminación de sobrenadantes
Una vez que las células están sedimentadas, el sobrenadante (el líquido sobre el sedimento) debe eliminarse cuidadosamente sin alterar el sedimento de la célula. Esto generalmente se realiza usando una micropipette. Es crucial realizar este paso meticulosamente para evitar perder cualquier célula.
● Asegurar una pérdida mínima de gránulo celular
Asegurar una pérdida mínima del sedimento celular implica pipeteo cuidadoso y, si es necesario, múltiples rondas de centrifugación y eliminación de sobrenadante. El objetivo es mantener tantas células como sea posible en el perdigón para la máxima recuperación de ADN.
Adición de solución de lisis de núcleos
● Componentes de la solución de lisis de núcleos
La solución de lisis de núcleo típicamente contiene un detergente (como SDS), un tampón (como Tris - HCl) y un agente quelante (como EDTA). El detergente interrumpe la membrana celular y la envoltura nuclear, liberando el contenido celular, incluido el ADN, en la solución.
● Papel en descomponer las paredes celulares
La solución de lisis de núcleo no solo lisea la membrana celular, sino que también desnaturaliza las proteínas y los lípidos, descomponiendo efectivamente las paredes celulares y los sobres nucleares para liberar el ADN en la solución.
Resuspensión de las células
● Pipeteo suave para evitar el cizallamiento de ADN
Una vez que se agrega la solución de lisis del núcleo, las células deben resuspendirse suavemente para evitar el corte de ADN. El corte puede dividir el ADN en fragmentos más pequeños, lo que puede ser problemático para aplicaciones aguas abajo que requieren ADN de alto peso molecular.
● Asegurar una resuspensión completa
La resuspensión completa asegura que todas las células se lisen uniformemente, maximizando la recuperación del ADN. Esto se puede lograr mediante pipeteo suave o agitando la solución a baja velocidad.
Incubación a las células de Lyse
● Configuración de temperatura para incubación
Las células resuspendidas se incuban a una temperatura específica para garantizar una lisis completa. Esto generalmente se hace a 37 ° C a 55 ° C. La temperatura y la duración exactos pueden variar según el protocolo y los requisitos específicos del kit de aislamiento de ADN que se utiliza.
● Duración requerida para una lisis efectiva
La duración típica de la incubación es de entre 20 y 30 minutos, pero se puede ajustar en función de la eficiencia de la lisis celular observada. La incubación prolongada puede ser necesaria para la lisis completa, pero debe equilibrarse contra el riesgo de degradación del ADN.
Enfriamiento a temperatura ambiente
● Importancia del enfriamiento gradual
Después de la incubación, el lisado se enfría gradualmente a temperatura ambiente. El enfriamiento gradual ayuda a estabilizar el ADN y minimiza el riesgo de choque térmico, lo que podría degradar el ADN.
● Efectos sobre el ADN y los restos celulares
El enfriamiento a la temperatura ambiente permite que los restos celulares precipiten, lo que hace que sea más fácil separar el ADN en los pasos posteriores. Esto también ayuda a estabilizar las actividades enzimáticas y facilita la eliminación de ARN mediante el tratamiento con ARNasa.
Adición de solución RNase
● Propósito de RNase en el procedimiento
La solución de RNase se agrega para degradar el ARN, que de otro modo podría consolidar con el ADN e interferir con las aplicaciones aguas abajo. RNase digiere selectivamente el ARN, dejando el ADN intacto.
● Prevención de la contaminación de ARN
La prevención de la contaminación de ARN es crucial para aplicaciones que requieren ADN puro, como PCR y secuenciación. El tratamiento con ARNasa asegura que el ADN aislado esté libre de contaminantes de ARN.
Purificación de ADN
● Métodos para separar el ADN de otros componentes celulares
Se pueden usar varios métodos para purificar el ADN del lisado. Estos incluyen la extracción de cloroformo de fenol, la precipitación de etanol y el uso de kits comerciales de ADN de E. coli. Cada método tiene sus pros y contras, con kits comerciales que ofrecen conveniencia y resultados consistentes.
● Consideraciones para la pureza del ADN
La pureza es un factor crítico para el éxito de las aplicaciones aguas abajo. Los kits comerciales, como el kit de ADN de terapia celular E. coli, están diseñados para producir ADN de alta pureza al eliminar efectivamente proteínas, lípidos y otros contaminantes.
Almacenamiento y manejo de ADN aislado
● Las mejores prácticas para almacenar ADN
Una vez purificado, el ADN debe almacenarse en un tampón adecuado, como el tampón TE, a - 20 ° C o - 80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Evite los ciclos frecuentes de congelación - descongelado, ya que pueden causar la degradación del ADN.
● Mantener la integridad del ADN para aplicaciones posteriores
Para mantener la integridad del ADN, use tubos y soluciones estériles y libres de nucleasas. Esto asegura que el ADN permanezca no contaminado y adecuado para aplicaciones como clonación, secuenciación y PCR.
Acerca deBluekit
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Tiempo de publicación: 2024 - 09 - 05 14:47:03
