L'isolement de l'ADN d'E. Coli est une procédure fondamentale en biologie moléculaire. Cet article vous guidera tout au long du processus, fournissant des étapes et des explications détaillées, en vous assurant à la fois de comprendre la science et les aspects pratiques de la procédure. Que vous soyez un chercheur chevronné ou un nouveau venu au laboratoire, ce guide sera une ressource précieuse.
Préparation de la suspension cellulaire
● Collecte de cellules E. coli
La première étape pour isoler l'ADN d'E. Coli consiste à collecter les cellules bactériennes. Cela nécessite généralement E. coli croissant dans un milieu liquide approprié jusqu'à ce qu'il atteigne la phase de croissance logarithmique. Le moment est crucial car les cellules de cette phase sont les plus viables et plus faciles à lyser, ce qui entraînera un rendement en ADN plus élevé.
● Ressegmenter les cellules dans un tampon approprié
Les cellules collectées sont ensuite remises en suspension dans un tampon approprié. Un choix commun est un tampon Tris - Edta (TE), qui aide à maintenir l'intégrité de l'ADN pendant le processus d'extraction. Le tampon sert à plusieurs fins: il stabilise le pH, chélate les cations divalents qui pourraient autrement dégrader l'ADN et fournit un environnement ionique optimal pour les réactions enzymatiques ultérieures.
Centrifugation aux cellules de granulés
● Paramètres de centrifugation (vitesse et temps)
Après avoir remis en suspension les cellules, la suspension est soumise à une centrifugation pour granuler les cellules. La vitesse de centrifugation et le temps sont des paramètres critiques. En règle générale, la centrifugation est effectuée à environ 4 000 - 6 000 g pendant 10 - 15 minutes à 4 ° C. Cela garantit que les cellules forment un culot serré au fond du tube à centrifugeuse.
● Importance de la bonne plomb
Un bondage approprié est essentiel pour séparer les cellules du milieu de croissance et d'autres composants solubles. Un culot bien formé rend les étapes suivantes plus faciles et plus efficaces, garantissant une perte minimale de cellules et, par conséquent, un rendement en ADN maximum.
Retrait du surnageant
● Techniques de suppression du surnageant
Une fois que les cellules sont granulées, le surnageant (le liquide au-dessus du culot) doit être soigneusement retiré sans déranger le culot cellulaire. Cela se fait généralement à l'aide d'une micropipette. Il est crucial d'effectuer cette étape méticuleusement pour éviter de perdre des cellules.
● Assurer une perte minimale de culot cellulaire
Assurer une perte minimale de la pastille cellulaire implique une pipetage minutieuse et, si nécessaire, plusieurs cycles de centrifugation et l'élimination du surnageant. L'objectif est de conserver autant de cellules que possible dans le culot pour une récupération maximale de l'ADN.
Ajout d'une solution de lyse de noyaux
● Composants de la solution de lyse de noyaux
La solution de lyse des noyaux contient généralement un détergent (comme SDS), un tampon (comme Tris - HCl) et un agent chélatant (comme EDTA). Le détergent perturbe la membrane cellulaire et l'enveloppe nucléaire, libérant le contenu cellulaire, y compris l'ADN, dans la solution.
● Rôle dans la rupture des parois cellulaires
La solution de lyse des noyaux non seulement lyse la membrane cellulaire mais dénaturie également les protéines et les lipides, décomposant efficacement les parois cellulaires et les enveloppes nucléaires pour libérer l'ADN dans la solution.
Remise en suspension des cellules
● Pipetage doux pour éviter le cisaillement de l'ADN
Une fois la solution de lyse des noyaux ajoutée, les cellules doivent être remises en suspension doucement pour éviter le cisaillement de l'ADN. Le cisaillement peut diviser l'ADN en fragments plus petits, ce qui peut être problématique pour les applications en aval qui nécessitent un ADN de poids moléculaire élevé.
● Assurer une remise en suspension complète
Une remise en suspension complète garantit que toutes les cellules sont lysées uniformément, maximisant la récupération de l'ADN. Cela peut être réalisé par une pipetage douce ou un vortexage de la solution à basse vitesse.
Incubation aux cellules lyse
● Paramètres de température pour l'incubation
Les cellules remises en suspension sont incubées à une température spécifique pour assurer une lyse complète. Cela se fait généralement à 37 ° C à 55 ° C. La température et la durée exactes peuvent varier en fonction du protocole et des exigences spécifiques du kit d'isolement d'ADN utilisé.
● Durée requise pour une lyse efficace
La durée typique de l'incubation se situe entre 20 et 30 minutes, mais elle peut être ajustée en fonction de l'efficacité de la lyse cellulaire observée. Une incubation prolongée peut être nécessaire pour une lyse complète, mais doit être équilibrée contre le risque de dégradation de l'ADN.
Refroidissement à température ambiante
● Importance du refroidissement progressif
Après incubation, le lysat est progressivement refroidi à température ambiante. Le refroidissement progressif aide à stabiliser l'ADN et minimise le risque de choc thermique, qui pourrait potentiellement dégrader l'ADN.
● Effets sur l'ADN et les débris cellulaires
Le refroidissement à température ambiante permet aux débris cellulaires de précipiter, ce qui facilite la séparation de l'ADN dans les étapes suivantes. Cela aide également à stabiliser les activités enzymatiques et facilite l'élimination de l'ARN par le traitement de la RNase.
Ajout de solution RNase
● Objectif de la RNase dans la procédure
La solution RNase est ajoutée à la dégradation de l'ARN, qui pourrait autrement purifier avec l'ADN et interférer avec les applications en aval. La RNase digère sélectivement l'ARN, laissant l'ADN intact.
● Empêcher la contamination de l'ARN
La prévention de la contamination par l'ARN est cruciale pour les applications qui nécessitent de l'ADN pur, comme la PCR et le séquençage. Le traitement RNase garantit que l'ADN isolé est exempt de contaminants d'ARN.
Purification de l'ADN
● Méthodes pour séparer l'ADN des autres composants cellulaires
Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour purifier l'ADN du lysat. Il s'agit notamment de l'extraction du phénol - chloroforme, des précipitations d'éthanol et de l'utilisation de kits ADN d'E. Coli commerciaux. Chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients, avec des kits commerciaux offrant une commodité et des résultats cohérents.
● Considérations pour la pureté de l'ADN
La pureté est un facteur critique pour le succès des applications en aval. Les kits commerciaux, tels que le kit ADN de la thérapie cellulaire E. coli, sont conçus pour produire de l'ADN élevé - pureté en éliminant efficacement les protéines, les lipides et d'autres contaminants.
Stockage et manipulation de l'ADN isolé
● Meilleures pratiques pour stocker l'ADN
Une fois purifiée, l'ADN doit être stocké dans un tampon approprié, comme le tampon TE, à - 20 ° C ou - 80 ° C pour un stockage long - Term. Évitez les cycles de gel fréquents car ils peuvent provoquer une dégradation de l'ADN.
● Maintenir l'intégrité de l'ADN pour les applications en aval
Pour maintenir l'intégrité de l'ADN, utilisez des tubes et des solutions stériles, nucléases - Free. Cela garantit que l'ADN reste non contaminé et adapté aux applications telles que le clonage, le séquençage et la PCR.
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Heure du poste: 2024 - 09 - 05 14:47:03
