DNA phân lập từ E. coli là một thủ tục cơ bản trong sinh học phân tử. Bài viết này sẽ hướng dẫn bạn trong toàn bộ quá trình, cung cấp các bước và giải thích chi tiết, đảm bảo bạn hiểu cả khoa học và các khía cạnh thực tế của thủ tục. Cho dù bạn là một nhà nghiên cứu dày dạn hoặc một người mới đến phòng thí nghiệm, hướng dẫn này sẽ là một nguồn tài nguyên quý giá.
Chuẩn bị huyền phù tế bào
● Bộ sưu tập các tế bào E. coli
Bước đầu tiên trong việc phân lập DNA từ E. coli liên quan đến việc thu thập các tế bào vi khuẩn. Điều này thường đòi hỏi E. coli phát triển trong một môi trường chất lỏng phù hợp cho đến khi nó đạt đến giai đoạn tăng trưởng logarit. Thời gian là rất quan trọng bởi vì các tế bào trong giai đoạn này là khả thi và dễ dàng hơn để lyse, điều này sẽ dẫn đến năng suất DNA cao hơn.
● Resuspending tế bào trong bộ đệm thích hợp
Các tế bào được thu thập sau đó được nối lại trong một bộ đệm phù hợp. Một lựa chọn phổ biến là bộ đệm Tris - edta (TE), giúp duy trì tính toàn vẹn của DNA trong quá trình chiết xuất. Bộ đệm phục vụ nhiều mục đích: nó ổn định pH, chelates cation hóa trị có thể làm suy giảm DNA và cung cấp một môi trường ion tối ưu cho các phản ứng enzyme tiếp theo.
Ly tâm đến các tế bào viên
● Thông số cho ly tâm (tốc độ và thời gian)
Sau khi nối lại các tế bào, hệ thống treo phải được ly tâm để viên các tế bào. Tốc độ và thời gian ly tâm là các thông số quan trọng. Thông thường, ly tâm được thực hiện ở khoảng 4.000 - 6.000 g trong 10 - 15 phút ở 4 ° C. Điều này đảm bảo rằng các tế bào tạo thành một viên chặt ở dưới cùng của ống ly tâm.
● Tầm quan trọng của việc viên thích hợp
Viên thích hợp là điều cần thiết để tách các tế bào khỏi môi trường tăng trưởng và các thành phần hòa tan khác. Một viên đạn được hình thành giúp các bước tiếp theo dễ dàng và hiệu quả hơn, đảm bảo mất tối thiểu các tế bào và do đó, năng suất DNA tối đa.
Loại bỏ phần nổi
● Kỹ thuật loại bỏ phần trên
Một khi các tế bào được phân giải, phần nổi phía trên (chất lỏng phía trên viên) phải được loại bỏ cẩn thận mà không làm xáo trộn viên tế bào. Điều này thường được thực hiện bằng cách sử dụng micropipette. Nó rất quan trọng để thực hiện bước này một cách tỉ mỉ để tránh mất bất kỳ ô nào.
● Đảm bảo mất tối thiểu các viên tế bào
Đảm bảo mất tối thiểu các viên tế bào liên quan đến quá trình ăn ống cẩn thận và, nếu cần thiết, nhiều vòng ly tâm và loại bỏ nổi phía trên. Mục tiêu là giữ càng nhiều tế bào càng tốt trong viên để phục hồi DNA tối đa.
Bổ sung dung dịch ly giải hạt nhân
● Các thành phần của dung dịch ly giải hạt nhân
Dung dịch ly giải hạt nhân thường chứa chất tẩy (như SDS), bộ đệm (như Tris - HCl) và tác nhân chelating (như EDTA). Chất tẩy rửa phá vỡ màng tế bào và vỏ hạt nhân, giải phóng các nội dung tế bào, bao gồm DNA, vào dung dịch.
● Vai trò trong việc phá vỡ thành tế bào
Dung dịch ly giải hạt nhân không chỉ ly giải màng tế bào mà còn biến tính protein và lipid, phá vỡ hiệu quả thành tế bào và phong bì hạt nhân để giải phóng DNA vào dung dịch.
Sự nối lại của các tế bào
● Ống nhẹ để tránh cắt DNA
Sau khi thêm dung dịch ly giải hạt nhân, các tế bào cần được nối lại nhẹ nhàng để tránh cắt DNA. Cắt có thể chia DNA thành các đoạn nhỏ hơn, có thể có vấn đề đối với các ứng dụng hạ nguồn yêu cầu cao - phân tử - Trọng lượng DNA.
● Đảm bảo hoàn chỉnh lại
Resuspension hoàn toàn đảm bảo rằng tất cả các tế bào được ly giải đồng đều, tối đa hóa phục hồi DNA. Điều này có thể đạt được bằng cách tạo đường ống nhẹ nhàng hoặc xoáy dung dịch ở tốc độ thấp.
Ủ các tế bào lyse
● Cài đặt nhiệt độ để ủ
Các tế bào được nối lại được ủ ở nhiệt độ cụ thể để đảm bảo ly giải hoàn toàn. Điều này thường được thực hiện ở 37 ° C đến 55 ° C. Nhiệt độ và thời gian chính xác có thể thay đổi tùy thuộc vào giao thức và các yêu cầu cụ thể của bộ phân lập DNA đang được sử dụng.
● Thời lượng cần thiết cho quá trình ly giải hiệu quả
Thời lượng điển hình để ủ là từ 20 đến 30 phút, nhưng nó có thể được điều chỉnh dựa trên hiệu quả của sự ly giải tế bào được quan sát. Việc ủ kéo dài có thể cần thiết cho quá trình ly giải hoàn toàn nhưng nên được cân bằng chống lại nguy cơ thoái hóa DNA.
Làm mát đến nhiệt độ phòng
● Tầm quan trọng của việc làm mát dần dần
Sau khi ủ, lysate được làm mát dần đến nhiệt độ phòng. Làm mát dần dần giúp ổn định DNA và giảm thiểu nguy cơ sốc nhiệt, có khả năng làm suy giảm DNA.
● Ảnh hưởng đến DNA và các mảnh vụn tế bào
Làm mát đến nhiệt độ phòng cho phép các mảnh vụn tế bào kết tủa, giúp việc tách DNA dễ dàng hơn trong các bước tiếp theo. Điều này cũng giúp ổn định các hoạt động của enzyme và tạo điều kiện cho việc loại bỏ RNA bằng cách điều trị RNase.
Bổ sung dung dịch RNase
● Mục đích của RNase trong thủ tục
Giải pháp RNase được thêm vào để làm suy giảm RNA, nếu không thì CO - Tinh chế bằng DNA và can thiệp vào các ứng dụng hạ nguồn. RNase có chọn lọc tiêu hóa RNA, khiến DNA nguyên vẹn.
● Ngăn chặn ô nhiễm RNA
Ngăn chặn ô nhiễm RNA là rất quan trọng đối với các ứng dụng yêu cầu DNA thuần túy, chẳng hạn như PCR và giải trình tự. Điều trị RNase đảm bảo rằng DNA bị cô lập không có chất gây ô nhiễm RNA.
Tinh chế DNA
● Phương pháp tách DNA với các thành phần tế bào khác
Một số phương pháp có thể được sử dụng để tinh chế DNA từ lysate. Chúng bao gồm chiết xuất phenol - chloroform, kết tủa ethanol và sử dụng bộ dụng cụ DNA E. coli thương mại. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm của nó, với bộ dụng cụ thương mại cung cấp kết quả thuận tiện và phù hợp.
● Cân nhắc về độ tinh khiết DNA
Độ tinh khiết là một yếu tố quan trọng cho sự thành công của các ứng dụng hạ nguồn. Bộ dụng cụ thương mại, chẳng hạn như liệu pháp tế bào E. coli DNA Kit, được thiết kế để tạo ra DNA độ tinh khiết cao bằng cách loại bỏ hiệu quả protein, lipid và các chất gây ô nhiễm khác.
Lưu trữ và xử lý DNA bị cô lập
● Thực hành tốt nhất để lưu trữ DNA
Sau khi được tinh chế, DNA nên được lưu trữ trong bộ đệm phù hợp, như bộ đệm TE, ở - 20 ° C hoặc - 80 ° C để lưu trữ dài - thời hạn. Tránh đóng băng thường xuyên - chu kỳ tan vì chúng có thể gây ra sự thoái hóa DNA.
● Duy trì tính toàn vẹn DNA cho các ứng dụng hạ nguồn
Để duy trì tính toàn vẹn DNA, sử dụng vô trùng, nuclease - ống và dung dịch miễn phí. Điều này đảm bảo rằng DNA vẫn không bị ô nhiễm và phù hợp cho các ứng dụng như nhân bản, giải trình tự và PCR.
VềBluekit
Jiangsu Hillgene đã thành lập trụ sở của mình (10.000㎡ nhà máy GMP và Trung tâm R & D) ở Tô Châu, nằm ở quận Wuzhong, Tô Châu, một thành phố Lakeshore của hồ Taihu xinh đẹp và hai địa điểm sản xuất ở Thâm Quyến và Thượng Hải, mở rộng mạng lưới sản xuất của nó. Địa điểm Bắc Carolina ở Mỹ hiện đang được xây dựng, tiếp tục lan truyền sự hiện diện toàn cầu của nó. Hillgene đã xây dựng một con đường rõ ràng để phát triển các sản phẩm trị liệu tế bào, từ khám phá đến phân phối, với các nền tảng sản xuất axit nucleic, nuôi cấy hệ thống treo miễn phí, phát triển quá trình đóng và thử nghiệm QC. Các sản phẩm của Bluekit được thiết kế để kiểm soát chất lượng, đảm bảo sự thành công của các đổi mới trị liệu di động.
Thời gian đăng: 2024 - 09 - 05 14:47:03
