Ізоляція ДНК від E. coli є основною процедурою молекулярної біології. Ця стаття проведе вас по всьому процесу, надаючи детальні кроки та пояснення, гарантуючи, що ви розумієте як науку, так і практичні аспекти процедури. Незалежно від того, що ви досвідчений дослідник чи новачок у лабораторії, цей посібник буде цінним ресурсом.
Підготовка клітинної суспензії
● Збір клітин E. coli
Перший крок у виділенні ДНК з кишкової палички передбачає збір бактеріальних клітин. Зазвичай це вимагає вирощування кишкової палички у відповідному рідкому середовищі, поки вона не досягне фази логарифмічного росту. Час має вирішальне значення, оскільки клітини на цій фазі найбільш життєздатні та простіші в лізі, що призведе до більш високого виходу ДНК.
● Результати клітин у відповідному буфері
Потім зібрані клітини ресуспедують у відповідному буфері. Загальним вибором є буфер Tris - EDTA (TE), який допомагає підтримувати цілісність ДНК під час вилучення. Буфер служить декількома цілями: він стабілізує рН, хелатів двовалентних катіонів, які в іншому випадку можуть погіршити ДНК, і забезпечує оптимальне іонне середовище для подальших ферментативних реакцій.
Центрифугування до гранул
● Параметри для центрифугування (швидкість і час)
Після повторного розставлення клітин суспензію піддається центрифугуванню для гранул клітин. Швидкість центрифугування та час - критичні параметри. Зазвичай центрифугування проводиться близько 4000 - 6000 г протягом 10 - 15 хвилин при 4 ° С. Це гарантує, що клітини утворюють щільну гранулу внизу трубки центрифуги.
● Важливість належного гранулування
Правильне гранулювання має важливе значення для відокремлення клітин від середовища росту та інших розчинних компонентів. Сформована гранула полегшує наступні кроки простішими та ефективнішими, забезпечуючи мінімальну втрату клітин і, отже, максимальний вихід ДНК.
Видалення супернатанту
● Методи видалення супернатанту
Після того, як клітини грануліть, супернатант (рідина над гранулами) повинен бути ретельно видалений, не порушуючи клітинний гранул. Зазвичай це робиться за допомогою мікропіпети. Важливо виконати цей крок ретельно, щоб уникнути втрати будь -яких клітин.
● Забезпечення мінімальної втрати клітинних гранул
Забезпечення мінімальних втрат клітинного гранули передбачає ретельне піпетування та, якщо це необхідно, кілька раундів центрифугування та видалення супернатанту. Мета полягає в тому, щоб зберегти якомога більше клітин у гранулі для максимального відновлення ДНК.
Додавання розчину ядер
● Компоненти розчину ядра лізису
Розчин ядра лізису зазвичай містить миючий засіб (як SDS), буфер (наприклад, Tris - HCl) та хелатуючий засіб (як EDTA). Миючий засіб порушує клітинну мембрану та ядерну оболонку, вивільняючи клітинний вміст, включаючи ДНК, у розчин.
● Роль у руйнуванні клітинних стінок
Розчин ядра лізису не лише лізує клітинну мембрану, але й денатуризує білки та ліпіди, ефективно розбиваючи клітинні стінки та ядерні конверти, щоб вивільнити ДНК у розчин.
Ресуспензія клітин
● Ніжне піпетування, щоб уникнути стрижки ДНК
Після додавання розчину ядра клітини потрібно обережно ресуспендувати, щоб уникнути стрижки ДНК. Зріжок може розбити ДНК на менші фрагменти, що може бути проблематичним для застосувань нижче за течією, які потребують високої - молекулярної - ваги ДНК.
● Забезпечення повної ресуспензії
Повна ресуспензія гарантує, що всі клітини лізирні рівномірно, максимізуючи відновлення ДНК. Цього можна досягти ніжним піпетуванням або вихованням розчину з низькою швидкістю.
Інкубація до клітин лізе
● Налаштування температури для інкубації
Ресуспендовані клітини інкубують при певній температурі для забезпечення повного лізису. Зазвичай це робиться при 37 ° С до 55 ° С. Точна температура та тривалість можуть змінюватись залежно від протоколу та конкретних вимог використання набору ізоляції ДНК.
● Тривалість, необхідна для ефективного лізису
Типова тривалість інкубації становить від 20 до 30 хвилин, але її можна відрегулювати на основі ефективності спостережуваного лізису клітин. Тривала інкубація може бути необхідною для повного лізису, але повинна бути збалансована проти ризику деградації ДНК.
Охолодження до кімнатної температури
● Важливість поступового охолодження
Після інкубації лізат поступово охолоджується до кімнатної температури. Поступове охолодження допомагає стабілізувати ДНК і мінімізує ризик теплового шоку, що потенційно може погіршити ДНК.
● Вплив на ДНК та клітинні уламки
Охолодження до кімнатної температури дозволяє осадити клітинний сміття, що полегшує відокремлення ДНК на наступних етапах. Це також допомагає стабілізувати діяльність ферменту та полегшує видалення РНК методом лікування РНКази.
Додавання розчину RNase
● Мета РНКаза в процедурі
Розчин RNASE додається для погіршення РНК, яка в іншому випадку може порівняти ДНК і заважати застосуванню нижче за течією. RNASE вибірково перетравлює РНК, залишаючи ДНК неушкодженою.
● запобігання забрудненню РНК
Попередження забруднення РНК має вирішальне значення для застосувань, які потребують чистої ДНК, наприклад, ПЛР та секвенування. Лікування РНКаза гарантує, що ізольована ДНК не містить забруднень РНК.
Очищення ДНК
● Методи відокремлення ДНК від інших клітинних компонентів
Для очищення ДНК з лізату можна використовувати кілька методів. До них відносяться фенол - видобутки хлороформ, осадження етанолу та використання комерційних наборів ДНК E. coli. Кожен метод має свої плюси і мінуси, комерційні набори пропонують зручність та послідовні результати.
● Міркування щодо чистоти ДНК
Чистота є критичним фактором для успіху додатків нижче за течією. Комерційні набори, такі як клітинна терапія ДНК E. coli, призначені для отримання високої - чистоти ДНК шляхом ефективного видалення білків, ліпідів та інших забруднень.
Зберігання та обробка ізольованої ДНК
● Найкращі практики зберігання ДНК
Після очищення ДНК слід зберігати у відповідному буфері, як, наприклад, буфер TE, при - 20 ° C або - 80 ° C для тривалого - тривалого зберігання. Уникайте частих циклів заморожування - Відпагання, оскільки вони можуть спричинити деградацію ДНК.
● Підтримка цілісності ДНК для додатків нижче за течією
Для підтримки цілісності ДНК використовуйте стерильні, нуклеази - вільні трубки та розчини. Це гарантує, що ДНК залишається незабрудненою та придатною для таких застосувань, як клонування, секвенування та ПЛР.
ПроБлакит
Jiangsu Hillgene встановив штаб -квартиру (10 000 ㎡ GMP -рослини та науково -дослідний центр) у Сучжоу, розташованому в районі Вучжун, Сучжоу, Лейкшор -Сіті прекрасного озера Тайху, і два виробничі майданчики в Шеньчжень і Шанхай, що подовжують свою виробничу мережу на Niver -Cwide. Наразі майданчик Північної Кароліни в США будується, що ще більше поширює свою глобальну присутність. Hillgene побудував експрес -шлях для розробки продуктів клітинної терапії, від відкриття до доставки, з платформами для виробництва нуклеїнової кислоти, сироваткою - Вільна підвісна культивування, розробка закритих процесів та тестування КК. Продукти BlueKit розроблені для контролю якості, забезпечуючи успіх інновацій клітинної терапії.
Час повідомлення: 2024 - 09 - 05 14:47:03
