E. coli'den DNA'nın izole edilmesi, moleküler biyolojide temel bir prosedürdür. Bu makale, tüm süreç boyunca size yol göstererek, hem bilimi hem de prosedürün pratik yönlerini anlamanızı sağlayan ayrıntılı adımlar ve açıklamalar sağlayacaktır. Tecrübeli bir araştırmacı ya da laboratuvarda yeni gelen olun, bu kılavuz değerli bir kaynak olacaktır.
Hücre süspansiyonunun hazırlanması
● E. coli hücrelerinin toplanması
E. coli'den DNA'yı izole etmenin ilk adımı bakteriyel hücrelerin toplanmasını içerir. Bu genellikle logaritmik büyüme fazına ulaşana kadar uygun bir sıvı ortamda E. coli'nin büyümesini gerektirir. Zamanlama çok önemlidir, çünkü bu fazdaki hücreler en uygun ve daha kolaydır, bu da daha yüksek DNA verimine neden olacaktır.
● Hücreleri uygun bir tamponda yeniden süsstüze
Toplanan hücreler daha sonra uygun bir tamponda yeniden süspanse edilir. Ortak bir seçim, ekstraksiyon işlemi sırasında DNA'nın bütünlüğünün korunmasına yardımcı olan bir Tris - EDTA (TE) tamponudur. Tampon çoklu amaçlara hizmet eder: pH'ı stabilize eder, aksi takdirde DNA'yı bozabilecek ve sonraki enzimatik reaksiyonlar için optimal bir iyonik ortam sağlar.
Pelet hücrelerine santrifüjleme
● Santrifüj için parametreler (hız ve zaman)
Hücreleri yeniden sattıktan sonra, süspansiyon hücreleri peletlemek için santrifüjlemeye tabi tutulur. Santrifüj hızı ve süresi kritik parametrelerdir. Tipik olarak santrifüj, 4 ° C'de 10 - 15 dakika boyunca yaklaşık 4.000 - 6.000 g'de gerçekleştirilir. Bu, hücrelerin santrifüj tüpünün altında sıkı bir pelet oluşturmasını sağlar.
● Uygun peletlemenin önemi
Hücreleri büyüme ortamından ve diğer çözünür bileşenlerden ayırmak için uygun pelet gereklidir. Kuyu - oluşturulmuş bir pelet, sonraki adımları daha kolay ve daha verimli hale getirir, bu da minimum hücre kaybını ve dolayısıyla maksimum DNA verimini sağlar.
Süpernatantın kaldırılması
● Süpernatant çıkarma teknikleri
Hücreler peletlendikten sonra, süpernatan (peletin üzerindeki sıvı) hücre peletini bozmadan dikkatlice çıkarılmalıdır. Bu genellikle bir mikropipet kullanılarak yapılır. Herhangi bir hücreyi kaybetmekten kaçınmak için bu adımı titizlikle gerçekleştirmek çok önemlidir.
● Minimum hücre pelet kaybını sağlamak
Hücre peletinde minimum kaybın sağlamak, dikkatli pipetlemeyi ve gerekirse çoklu mermi santrifüj ve süpernatan çıkarmayı içerir. Amaç, maksimum DNA geri kazanımı için pelette mümkün olduğunca çok hücre tutmaktır.
Çekirdek lizis çözeltisinin ilavesi
● Çekirdek liziz çözeltisinin bileşenleri
Çekirdek lizis çözeltisi tipik olarak bir deterjan (SD'ler gibi), bir tampon (Tris - HCL gibi) ve bir şelalama maddesi (EDTA gibi) içerir. Deterjan, hücre zarını ve nükleer zarfı bozar ve DNA dahil hücresel içerikleri çözeltiye bırakır.
● Hücre duvarlarının parçalanmasında rol
Çekirdek lizis çözeltisi sadece hücre zarını lizat etmekle kalmaz, aynı zamanda proteinleri ve lipitleri de denatürleştirir, DNA'yı çözeltiye serbest bırakmak için hücre duvarlarını ve nükleer zarfları etkili bir şekilde parçaladı.
Hücrelerin yeniden süspansiyonu
● DNA kesmesini önlemek için nazik pipetleme
Çekirdek liziz çözeltisi eklendikten sonra, DNA kesilmesini önlemek için hücrelerin hafifçe yeniden süspanse edilmesi gerekir. Kesme, DNA'yı yüksek - moleküler - ağırlık DNA gerektiren aşağı akış uygulamaları için sorunlu olabilen daha küçük fragmanlara bölebilir.
● Tam yeniden süslemenin sağlanması
Tam yeniden süspansiyon, tüm hücrelerin düzgün bir şekilde lize edilmesini sağlar ve DNA geri kazanımını en üst düzeye çıkarır. Bu, çözeltiyi düşük bir hızda hafifçe pipetleme veya vorteksleme ile elde edilebilir.
Lyse hücrelerine inkübasyon
● İnkübasyon için sıcaklık ayarları
Yeniden süspanse edilmiş hücreler, tam liziz sağlamak için belirli bir sıcaklıkta inkübe edilir. Bu genellikle 37 ° C ila 55 ° C'de yapılır. Kesin sıcaklık ve süre, kullanılan DNA izolasyon kitinin protokole ve spesifik gereksinimlerine bağlı olarak değişebilir.
● Etkili lizis için gereken süre
İnkübasyon için tipik süre 20 ila 30 dakika arasındadır, ancak gözlenen hücre lizisinin etkinliğine göre ayarlanabilir. Tam lizis için uzun süreli inkübasyon gerekebilir, ancak DNA bozulması riskine karşı dengelenmelidir.
Oda sıcaklığına kadar soğutma
● kademeli soğutmanın önemi
İnkübasyondan sonra, lizat yavaş yavaş oda sıcaklığına soğutulur. Kademeli soğutma, DNA'nın stabilize edilmesine yardımcı olur ve DNA'yı potansiyel olarak bozabilecek termal şok riskini en aza indirir.
● DNA ve hücresel kalıntılar üzerindeki etkiler
Oda sıcaklığına soğutma, hücresel kalıntıların çökelmesini sağlar, bu da sonraki adımlarda DNA'yı ayırmayı kolaylaştırır. Bu aynı zamanda enzim aktivitelerini stabilize etmeye yardımcı olur ve RNA'nın RNaz tedavisi ile çıkarılmasını kolaylaştırır.
RNase Çözeltisinin Eklenmesi
● Prosedürde RNazın Amacı
RNase çözeltisi, aksi takdirde DNA ile arıtabilir ve aşağı akış uygulamalarına müdahale edebilen RNA'yı bozar. RNaz, DNA'yı sağlam bırakarak RNA'yı seçici olarak sindirir.
● RNA kontaminasyonunu önlemek
RNA kontaminasyonunu önlemek, PCR ve sekanslama gibi saf DNA gerektiren uygulamalar için çok önemlidir. RNaz tedavisi, izole edilmiş DNA'nın RNA kontaminantlarından arınmış olmasını sağlar.
DNA'nın saflaştırılması
● DNA'yı diğer hücresel bileşenlerden ayırmak için yöntemler
Lizattan DNA'yı saflaştırmak için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Bunlar fenol - kloroform ekstraksiyonu, etanol çökelmesi ve ticari E. coli DNA kitleri kullanmayı içerir. Her yöntemin artıları ve eksileri vardır, ticari kitler kolaylık ve tutarlı sonuçlar sunar.
● DNA saflığı için hususlar
Saflık, aşağı akış uygulamalarının başarısı için kritik bir faktördür. Hücre Terapisi E. coli DNA kiti gibi ticari kitler, proteinleri, lipitleri ve diğer kirleticileri etkili bir şekilde çıkararak yüksek - saflık DNA'sı verecek şekilde tasarlanmıştır.
İzole DNA'nın depolanması ve kullanımı
● DNA'yı depolamak için en iyi uygulamalar
Saflaştırıldıktan sonra DNA, TE tamponu gibi uygun bir tamponda, - 20 ° C'de veya uzun - terim depolama için 80 ° C'de saklanmalıdır. DNA bozulmasına neden olabileceği için sık sık donma - çözülme döngülerinden kaçının.
● Akış aşağı uygulamalar için DNA bütünlüğünün korunması
DNA bütünlüğünü korumak için steril, nükleaz - serbest tüpler ve çözeltiler kullanın. Bu, DNA'nın klonlama, sekanslama ve PCR gibi uygulamalar için kirlenmemiş ve uygun kalmasını sağlar.
HakkındaBluekit
Jiangsu Hillgene, Wuzhong bölgesinde bulunan Suzhou, güzel Taihu Gölü'nün göl kıyısı şehri ve Shenzhen ve Şangay'daki iki üretim alanı, üretim ağı ülkesini genişleterek karargahını (10.000㎡ GMP bitkileri ve Ar -Ge merkezi) kurdu. ABD'deki Kuzey Carolina sitesi şu anda yapım aşamasındadır ve küresel varlığını daha da yaymaktadır. Hillgene, nükleik asit üretimi platformları, serum - serbest süspansiyon kültürü, kapalı süreç geliştirme ve QC testi ile hücresel terapi ürünleri geliştirmek için ekspres bir yol oluşturmuştur. Bluekit ürünleri, hücresel terapi yeniliklerinin başarısını sağlayarak kalite kontrolü için tasarlanmıştır.
Gönderme Zamanı: 2024 - 09 - 05 14:47:03
