Ang paghiwalay ng DNA mula sa E. coli ay isang pangunahing pamamaraan sa molekular na biology. Ang artikulong ito ay lalakad sa iyo sa buong proseso, na nagbibigay ng detalyadong mga hakbang at paliwanag, tinitiyak na maunawaan mo ang parehong agham at ang mga praktikal na aspeto ng pamamaraan. Kung ikaw ay isang napapanahong mananaliksik o isang bagong dating sa lab, ang gabay na ito ay magiging isang mahalagang mapagkukunan.
Paghahanda ng suspensyon ng cell
● Koleksyon ng mga E. coli cells
Ang unang hakbang sa paghiwalayin ang DNA mula sa E. coli ay nagsasangkot ng pagkolekta ng mga cell ng bakterya. Karaniwan itong nangangailangan ng paglaki ng E. coli sa isang angkop na likidong daluyan hanggang sa maabot nito ang yugto ng paglago ng logarithmic. Mahalaga ang tiyempo dahil ang mga cell sa yugtong ito ay pinaka -mabubuhay at mas madaling mag -lyse, na magreresulta sa mas mataas na ani ng DNA.
● Resuspending cells sa isang naaangkop na buffer
Ang mga nakolekta na mga cell ay pagkatapos ay resuspended sa isang angkop na buffer. Ang isang karaniwang pagpipilian ay isang tris - EDTA (TE) buffer, na tumutulong na mapanatili ang integridad ng DNA sa panahon ng proseso ng pagkuha. Naghahain ang buffer ng maraming mga layunin: nagpapatatag ito sa pH, chelates divalent cations na kung hindi man ay magpapabagal sa DNA, at nagbibigay ng isang pinakamainam na kapaligiran ng ionic para sa kasunod na mga reaksyon ng enzymatic.
Sentripugasyon sa mga cell ng pellet
● Mga parameter para sa sentripugasyon (bilis at oras)
Matapos maibalik ang mga cell, ang suspensyon ay sumailalim sa sentripugasyon upang i -pellet ang mga cell. Ang bilis ng sentripugasyon at oras ay mga kritikal na mga parameter. Karaniwan, ang sentripugasyon ay isinasagawa sa paligid ng 4,000 - 6,000 g para sa 10 - 15 minuto sa 4 ° C. Tinitiyak nito na ang mga cell ay bumubuo ng isang masikip na pellet sa ilalim ng tubo ng sentripuge.
● Kahalagahan ng tamang pelleting
Ang wastong pelleting ay mahalaga upang paghiwalayin ang mga cell mula sa daluyan ng paglago at iba pang natutunaw na mga sangkap. Ang isang mahusay na - nabuo na pellet ay ginagawang mas madali at mas mahusay ang kasunod na mga hakbang, tinitiyak ang kaunting pagkawala ng mga cell at, samakatuwid, maximum na ani ng DNA.
Pag -alis ng supernatant
● Mga pamamaraan para sa pag -alis ng supernatant
Kapag ang mga cell ay pelleted, ang supernatant (ang likido sa itaas ng pellet) ay dapat na maingat na tinanggal nang hindi nakakagambala sa cell pellet. Ito ay karaniwang ginagawa gamit ang isang micropipette. Mahalaga na maisagawa ang hakbang na ito upang maiwasan ang pagkawala ng anumang mga cell.
● Tinitiyak ang kaunting pagkawala ng cell pellet
Ang pagtiyak ng kaunting pagkawala ng cell pellet ay nagsasangkot ng maingat na pipetting at, kung kinakailangan, maraming mga pag -ikot ng sentripugasyon at pag -alis ng supernatant. Ang layunin ay upang mapanatili ang maraming mga cell hangga't maaari sa pellet para sa maximum na pagbawi ng DNA.
Pagdagdag ng solusyon sa lysis ng nuclei
● Mga sangkap ng solusyon sa lysis ng nuclei
Ang solusyon sa lysis ng nuclei ay karaniwang naglalaman ng isang naglilinis (tulad ng SDS), isang buffer (tulad ng TRIS - HCl), at isang ahente ng chelating (tulad ng EDTA). Ang detergent ay nakakagambala sa cell lamad at sobre ng nuklear, na inilalabas ang mga nilalaman ng cellular, kabilang ang DNA, sa solusyon.
● Papel sa pagbagsak ng mga pader ng cell
Ang solusyon sa lysis ng nuclei ay hindi lamang naglalagay ng lamad ng cell ngunit din ang denaturize ng mga protina at lipid, na epektibong masira ang mga pader ng cell at mga sobre ng nuklear upang palayain ang DNA sa solusyon.
Resuspension ng mga cell
● Magiliw na pipetting upang maiwasan ang paggugupit ng DNA
Kapag idinagdag ang solusyon sa nuclei lysis, ang mga cell ay kailangang ma -resuspended nang malumanay upang maiwasan ang paggugupit ng DNA. Ang paggugupit ay maaaring masira ang DNA sa mas maliit na mga fragment, na maaaring may problema para sa mga aplikasyon ng agos na nangangailangan ng mataas na - molekular - timbang ng DNA.
● Tinitiyak ang kumpletong resuspension
Tinitiyak ng kumpletong resuspension na ang lahat ng mga cell ay naka -lysed nang pantay -pantay, na -maximize ang pagbawi ng DNA. Ito ay maaaring makamit sa pamamagitan ng banayad na pipetting o pag -vortexing ng solusyon sa isang mababang bilis.
Pagpapapisa ng mga cell ng lyse
● Mga setting ng temperatura para sa pagpapapisa ng itlog
Ang mga resuspended cells ay natupok sa isang tiyak na temperatura upang matiyak ang kumpletong lysis. Ito ay karaniwang ginagawa sa 37 ° C hanggang 55 ° C. Ang eksaktong temperatura at tagal ay maaaring mag -iba depende sa protocol at ang mga tiyak na kinakailangan ng DNA paghihiwalay kit na ginagamit.
● Tagal na kinakailangan para sa epektibong lysis
Ang karaniwang tagal para sa pagpapapisa ng itlog ay nasa pagitan ng 20 hanggang 30 minuto, ngunit maaari itong maiakma batay sa kahusayan ng cell lysis na sinusunod. Ang matagal na pagpapapisa ng itlog ay maaaring kailanganin para sa kumpletong lysis ngunit dapat na balanse laban sa panganib ng pagkasira ng DNA.
Paglamig sa temperatura ng silid
● Kahalagahan ng unti -unting paglamig
Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, ang lysate ay unti -unting pinalamig sa temperatura ng silid. Ang unti -unting paglamig ay tumutulong sa pag -stabilize ng DNA at pinaliit ang panganib ng thermal shock, na maaaring mabagal ang DNA.
● Mga epekto sa DNA at mga cellular na labi
Ang paglamig sa temperatura ng silid ay nagbibigay -daan sa mga labi ng cellular na umuusbong, na ginagawang mas madali upang paghiwalayin ang DNA sa mga kasunod na hakbang. Makakatulong din ito upang patatagin ang mga aktibidad ng enzyme at pinadali ang pag -alis ng RNA sa pamamagitan ng paggamot sa RNase.
Pagdagdag ng solusyon sa RNase
● Layunin ng RNase sa pamamaraan
Ang solusyon ng RNase ay idinagdag sa pagpapabagal sa RNA, na kung hindi man ay co - linisin sa DNA at makagambala sa mga aplikasyon ng agos. Pinipili ng RNase ang RNA, na iniiwan ang DNA na buo.
● Pag -iwas sa kontaminasyon ng RNA
Ang pag -iwas sa kontaminasyon ng RNA ay mahalaga para sa mga aplikasyon na nangangailangan ng purong DNA, tulad ng PCR at pagkakasunud -sunod. Tinitiyak ng paggamot ng RNase na ang nakahiwalay na DNA ay libre mula sa mga kontaminadong RNA.
Paglilinis ng DNA
● Mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng DNA mula sa iba pang mga sangkap ng cellular
Maraming mga pamamaraan ang maaaring magamit upang linisin ang DNA mula sa lysate. Kasama dito ang phenol - pagkuha ng chloroform, pag -ulan ng ethanol, at paggamit ng komersyal na E. coli DNA kit. Ang bawat pamamaraan ay may mga kalamangan at kahinaan nito, na may mga komersyal na kit na nag -aalok ng kaginhawaan at pare -pareho na mga resulta.
● Mga pagsasaalang -alang para sa kadalisayan ng DNA
Ang kadalisayan ay isang kritikal na kadahilanan para sa tagumpay ng mga aplikasyon ng agos. Ang mga komersyal na kit, tulad ng cell therapy E. coli DNA kit, ay idinisenyo upang magbunga ng mataas na - kadalisayan DNA sa pamamagitan ng epektibong pag -alis ng mga protina, lipid, at iba pang mga kontaminado.
Pag -iimbak at paghawak ng nakahiwalay na DNA
● Pinakamahusay na kasanayan para sa pag -iimbak ng DNA
Kapag nalinis, ang DNA ay dapat na naka -imbak sa isang angkop na buffer, tulad ng TE buffer, sa - 20 ° C o - 80 ° C para sa mahabang - term na imbakan. Iwasan ang madalas na pag -freeze - Thaw cycle dahil maaari silang maging sanhi ng pagkasira ng DNA.
● Pagpapanatili ng integridad ng DNA para sa mga aplikasyon ng agos
Upang mapanatili ang integridad ng DNA, gumamit ng sterile, nuclease - libreng mga tubo at solusyon. Tinitiyak nito na ang DNA ay nananatiling hindi nakatago at angkop para sa mga aplikasyon tulad ng pag -clone, pagkakasunud -sunod, at PCR.
Tungkol saBluekit
Itinatag ng Jiangsu Hillgene ang punong tanggapan nito (10,000㎡ GMP Plants at R&D Center) sa Suzhou, na matatagpuan sa distrito ng Wuzhong, Suzhou, isang lungsod ng Lakeshore ng magandang Taihu Lake, at dalawang mga site ng pagmamanupaktura sa Shenzhen at Shanghai, na nagpapalawak ng network ng pagmamanupaktura sa buong bansa. Ang site ng North Carolina sa US ay kasalukuyang nasa ilalim ng konstruksyon, na higit na kumakalat sa pandaigdigang pagkakaroon nito. Ang Hillgene ay nagtayo ng isang express pathway para sa pagbuo ng mga produkto ng cellular therapy, mula sa pagtuklas hanggang sa paghahatid, na may mga platform para sa paggawa ng nucleic acid, suwero - libreng pagsuspinde ng pagsuspinde, saradong proseso ng pag -unlad, at pagsubok sa QC. Ang mga produktong Bluekit ay idinisenyo para sa kalidad ng kontrol, tinitiyak ang tagumpay ng mga makabagong mga pagbabago sa therapy.
Oras ng Mag -post: 2024 - 09 - 05 14:47:03
