การแยก DNA จาก E. coli เป็นขั้นตอนพื้นฐานในชีววิทยาโมเลกุล บทความนี้จะนำคุณผ่านกระบวนการทั้งหมดโดยให้รายละเอียดขั้นตอนและคำอธิบายเพื่อให้แน่ใจว่าคุณเข้าใจทั้งวิทยาศาสตร์และด้านการปฏิบัติของกระบวนการ ไม่ว่าคุณจะเป็นนักวิจัยที่มีประสบการณ์หรือผู้มาใหม่ไปที่ห้องปฏิบัติการคู่มือนี้จะเป็นทรัพยากรที่มีค่า
การเตรียมการระงับเซลล์
●การรวบรวมเซลล์ E. coli
ขั้นตอนแรกในการแยก DNA จาก E. coli เกี่ยวข้องกับการรวบรวมเซลล์แบคทีเรีย สิ่งนี้มักจะต้องมีการเติบโตของอีโคไลในสื่อของเหลวที่เหมาะสมจนกว่าจะถึงขั้นตอนการเจริญเติบโตของลอการิทึม เวลามีความสำคัญเนื่องจากเซลล์ในระยะนี้มีศักยภาพมากที่สุดและง่ายต่อการ LYSE ซึ่งจะส่งผลให้ผลผลิตดีเอ็นเอสูงขึ้น
●การแขวนเซลล์ใหม่ในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม
เซลล์ที่รวบรวมจะถูกแขวนลอยอีกครั้งในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม ตัวเลือกทั่วไปคือบัฟเฟอร์ Tris - EDTA (TE) ซึ่งช่วยรักษาความสมบูรณ์ของ DNA ในระหว่างกระบวนการสกัด บัฟเฟอร์ให้บริการหลายจุดประสงค์: มันทำให้ค่า pH มีความเสถียร, คีเลตไพเพอร์ไพเพอร์ซึ่งอาจลดระดับดีเอ็นเอและให้สภาพแวดล้อมไอออนิกที่ดีที่สุดสำหรับปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่ตามมา
การหมุนเหวี่ยงไปยังเซลล์เม็ด
●พารามิเตอร์สำหรับการหมุนเหวี่ยง (ความเร็วและเวลา)
หลังจากการแขวนเซลล์ใหม่การระงับจะถูกหมุนเหวี่ยงเพื่อทำให้เซลล์เม็ด ความเร็วและเวลาหมุนเหวี่ยงเป็นพารามิเตอร์ที่สำคัญ โดยทั่วไปแล้วการหมุนเหวี่ยงจะดำเนินการที่ประมาณ 4,000 - 6,000 กรัมเป็นเวลา 10 - 15 นาทีที่ 4 ° C สิ่งนี้ทำให้มั่นใจได้ว่าเซลล์จะเป็นเม็ดแน่นที่ด้านล่างของท่อหมุนเหวี่ยง
●ความสำคัญของการอัดเม็ดที่เหมาะสม
การอัดเม็ดที่เหมาะสมเป็นสิ่งจำเป็นในการแยกเซลล์ออกจากสื่อการเจริญเติบโตและส่วนประกอบที่ละลายได้อื่น ๆ เม็ดที่ดี - ที่เกิดขึ้นทำให้ขั้นตอนต่อมาง่ายขึ้นและมีประสิทธิภาพมากขึ้นทำให้มั่นใจได้ว่าการสูญเสียเซลล์น้อยที่สุดและดังนั้นผลผลิตดีเอ็นเอสูงสุด
การกำจัดส่วนเกิน
●เทคนิคการกำจัดส่วนเกิน
เมื่อเซลล์ถูกอัดเป็นเม็ดแล้ว supernatant (ของเหลวเหนือเม็ด) จะต้องถูกลบออกอย่างระมัดระวังโดยไม่รบกวนเม็ดเซลล์ โดยปกติจะทำโดยใช้ micropipette เป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องทำตามขั้นตอนนี้อย่างพิถีพิถันเพื่อหลีกเลี่ยงการสูญเสียเซลล์ใด ๆ
●สร้างความมั่นใจว่าการสูญเสียเม็ดเซลล์น้อยที่สุด
การสร้างความมั่นใจว่าการสูญเสียเม็ดเซลล์น้อยที่สุดนั้นเกี่ยวข้องกับการปิเปตอย่างระมัดระวังและหากจำเป็นหากจำเป็นหลายรอบของการหมุนเหวี่ยงและการกำจัด supernatant เป้าหมายคือการรักษาเซลล์ให้มากที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ในเม็ดเพื่อการกู้คืนดีเอ็นเอสูงสุด
การเพิ่มสารละลายนิวเคลียส lysis
●ส่วนประกอบของสารละลายนิวเคลียส lysis
สารละลายนิวเคลียส lysis มักจะมีผงซักฟอก (เช่น SDS), บัฟเฟอร์ (เช่น Tris - HCl) และตัวแทน chelating (เช่น EDTA) ผงซักฟอกขัดขวางเยื่อหุ้มเซลล์และซองจดหมายนิวเคลียร์ปล่อยเนื้อหาของเซลล์รวมถึง DNA เข้าสู่สารละลาย
●บทบาทในการทำลายผนังเซลล์
สารละลายนิวเคลียส lysis ไม่เพียง แต่ lyses เยื่อหุ้มเซลล์เท่านั้น แต่ยังทำให้โปรตีนและไขมันลดลงทำให้ผนังเซลล์และซองจดหมายนิวเคลียร์ปล่อย DNA เข้าไปในสารละลายได้อย่างมีประสิทธิภาพ
การแขวนลอยของเซลล์อีกครั้ง
●การปิเปตอ่อนโยนเพื่อหลีกเลี่ยงการตัด DNA
เมื่อเพิ่มสารละลายนิวเคลียส lysis เซลล์จะต้องถูกแขวนลอยใหม่เบา ๆ เพื่อหลีกเลี่ยงการตัด DNA การตัดสามารถแบ่ง DNA ออกเป็นชิ้นส่วนที่เล็กกว่าซึ่งอาจเป็นปัญหาสำหรับการใช้งานดาวน์สตรีมที่ต้องใช้ดีเอ็นเอสูง - โมเลกุล - น้ำหนัก
●สร้างความมั่นใจในการแขวนลอยใหม่อย่างสมบูรณ์
การแขวนลอยใหม่ที่สมบูรณ์ทำให้มั่นใจได้ว่าเซลล์ทั้งหมดจะได้รับการปรับปรุงอย่างสม่ำเสมอทำให้การกู้คืนดีเอ็นเอสูงสุด สิ่งนี้สามารถทำได้โดยการปิเปตที่อ่อนโยนหรือ vortexing วิธีแก้ปัญหาด้วยความเร็วต่ำ
การฟักตัวไปยังเซลล์ Lyse
●การตั้งค่าอุณหภูมิสำหรับการฟักตัว
เซลล์ที่ถูกแขวนไว้จะถูกบ่มที่อุณหภูมิที่เฉพาะเจาะจงเพื่อให้แน่ใจว่า lysis สมบูรณ์ โดยปกติจะทำที่ 37 ° C ถึง 55 ° C อุณหภูมิและระยะเวลาที่แน่นอนอาจแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับโปรโตคอลและข้อกำหนดเฉพาะของชุดแยกดีเอ็นเอที่ใช้
●ระยะเวลาที่จำเป็นสำหรับการสลายที่มีประสิทธิภาพ
ระยะเวลาทั่วไปสำหรับการฟักตัวอยู่ระหว่าง 20 ถึง 30 นาที แต่สามารถปรับได้ตามประสิทธิภาพของการสลายเซลล์ที่สังเกตได้ การฟักตัวเป็นเวลานานอาจจำเป็นสำหรับการสลายที่สมบูรณ์ แต่ควรมีความสมดุลกับความเสี่ยงของการสลายตัวของดีเอ็นเอ
การระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้อง
●ความสำคัญของการระบายความร้อนแบบค่อยเป็นค่อยไป
หลังจากการบ่มไลเซทจะค่อยๆเย็นลงที่อุณหภูมิห้อง การระบายความร้อนแบบค่อยเป็นค่อยไปช่วยในการทำให้ดีเอ็นเอเสถียรและลดความเสี่ยงของการกระแทกด้วยความร้อนซึ่งอาจทำให้ DNA ลดลง
●ผลกระทบต่อ DNA และเศษเซลล์
การระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้องช่วยให้เศษเซลล์ตกตะกอนทำให้ง่ายต่อการแยก DNA ในขั้นตอนต่อไป นอกจากนี้ยังช่วยรักษาเสถียรภาพกิจกรรมของเอนไซม์และอำนวยความสะดวกในการกำจัด RNA โดยการรักษาด้วย RNase
การเพิ่มโซลูชัน RNase
●วัตถุประสงค์ของ RNase ในขั้นตอน
โซลูชัน RNase จะถูกเพิ่มลงใน DEGRADE RNA ซึ่งอาจเป็นอย่างอื่นร่วมกับ DNA และแทรกแซงแอปพลิเคชันดาวน์สตรีม RNase เลือกย่อย RNA โดยปล่อยให้ดีเอ็นเอเหมือนเดิม
●ป้องกันการปนเปื้อนของ RNA
การป้องกันการปนเปื้อนของ RNA เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการใช้งานที่ต้องใช้ DNA บริสุทธิ์เช่น PCR และการจัดลำดับ การรักษา RNase ช่วยให้มั่นใจได้ว่า DNA ที่แยกได้นั้นปราศจากสารปนเปื้อน RNA
การทำให้บริสุทธิ์ของ DNA
●วิธีการแยก DNA ออกจากส่วนประกอบเซลล์อื่น ๆ
สามารถใช้วิธีการหลายวิธีในการชำระดีเอ็นเอจากไลเซท เหล่านี้รวมถึงการสกัดฟีนอล - คลอโรฟอร์มการเร่งรัดเอทานอลและการใช้ชุดดีเอ็นเออีโคไลเชิงพาณิชย์ แต่ละวิธีมีข้อดีและข้อเสียพร้อมชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์ที่ให้ความสะดวกสบายและผลลัพธ์ที่สอดคล้องกัน
●ข้อควรพิจารณาสำหรับความบริสุทธิ์ของดีเอ็นเอ
ความบริสุทธิ์เป็นปัจจัยสำคัญสำหรับความสำเร็จของแอปพลิเคชันปลายน้ำ ชุดอุปกรณ์เชิงพาณิชย์เช่นชุดการบำบัดด้วยเซลล์ E. coli DNA ได้รับการออกแบบมาเพื่อให้ได้ดีเอ็นเอความบริสุทธิ์สูงโดยการกำจัดโปรตีนไขมันและสารปนเปื้อนอื่น ๆ ได้อย่างมีประสิทธิภาพ
การจัดเก็บและการจัดการ DNA ที่แยกได้
●แนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับการจัดเก็บ DNA
เมื่อบริสุทธิ์แล้วดีเอ็นเอควรเก็บไว้ในบัฟเฟอร์ที่เหมาะสมเช่นบัฟเฟอร์ TE ที่ - 20 ° C หรือ - 80 ° C สำหรับการจัดเก็บระยะยาว - หลีกเลี่ยงการแช่แข็งบ่อยครั้ง - ละลายรอบเนื่องจากอาจทำให้เกิดการสลายตัวของดีเอ็นเอ
●รักษาความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอสำหรับแอปพลิเคชันดาวน์สตรีม
เพื่อรักษาความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอใช้การฆ่าเชื้อ, นิวเคลียส - หลอดฟรีและโซลูชัน สิ่งนี้ทำให้มั่นใจได้ว่า DNA ยังคงไม่ได้รับการปนเปื้อนและเหมาะสำหรับการใช้งานเช่นการโคลนนิ่งการจัดลำดับและ PCR
เกี่ยวกับบลูคิท
Jiangsu Hillgene ก่อตั้งสำนักงานใหญ่ (10,000 ㎡ GMP Plants และ R&D Centre) ในซูโจวตั้งอยู่ในเขต Wuzhong, Suzhou, เมืองทะเลสาบ Taihu ที่สวยงามและสถานที่ผลิตสองแห่งในเซินเจิ้น เว็บไซต์ North Carolina ในสหรัฐอเมริกากำลังอยู่ในระหว่างการก่อสร้าง Hillgene ได้สร้างเส้นทางด่วนสำหรับการพัฒนาผลิตภัณฑ์การบำบัดด้วยโทรศัพท์มือถือตั้งแต่การค้นพบไปจนถึงการส่งมอบด้วยแพลตฟอร์มสำหรับการผลิตกรดนิวคลีอิกซีรั่ม - การเพาะเลี้ยงช่วงล่างฟรีการพัฒนากระบวนการปิดและการทดสอบ QC ผลิตภัณฑ์ Bluekit ได้รับการออกแบบมาเพื่อการควบคุมคุณภาพเพื่อให้มั่นใจถึงความสำเร็จของนวัตกรรมการบำบัดด้วยโทรศัพท์มือถือ
เวลาโพสต์: 2024 - 09 - 05 14:47:03
