Kutenga DNA kutoka kwa E. coli ni utaratibu wa msingi katika biolojia ya Masi. Nakala hii itakutembea kupitia mchakato mzima, kutoa hatua za kina na maelezo, kuhakikisha unaelewa sayansi na mambo ya vitendo ya utaratibu. Ikiwa wewe ni mtafiti aliye na uzoefu au mgeni kwenye maabara, mwongozo huu utakuwa rasilimali muhimu.
Maandalizi ya kusimamishwa kwa seli
● Mkusanyiko wa seli za E. coli
Hatua ya kwanza ya kutenganisha DNA kutoka kwa E. coli inajumuisha kukusanya seli za bakteria. Hii kawaida inahitaji kuongezeka kwa E. coli katika kioevu kinachofaa hadi kufikia awamu ya ukuaji wa logarithmic. Wakati ni muhimu kwa sababu seli katika awamu hii zinafaa zaidi na ni rahisi kwa LYSE, ambayo itasababisha mavuno ya juu ya DNA.
● Kurudisha seli kwenye buffer inayofaa
Seli zilizokusanywa basi hurekebishwa katika buffer inayofaa. Chaguo la kawaida ni Tris - EDTA (TE) buffer, ambayo husaidia kudumisha uadilifu wa DNA wakati wa mchakato wa uchimbaji. Buffer hutumikia madhumuni mengi: hutuliza pH, chelates saruji ambazo zinaweza kudhoofisha DNA, na hutoa mazingira bora ya ioniki kwa athari za baadaye za enzymatic.
Centrifugation kwa seli za pellet
● Vigezo vya centrifugation (kasi na wakati)
Baada ya kusasisha seli, kusimamishwa kunakabiliwa na centrifugation ili kuweka seli. Kasi ya centrifugation na wakati ni vigezo muhimu. Kawaida, centrifugation inafanywa karibu 4,000 - 6,000 g kwa 10 - dakika 15 kwa 4 ° C. Hii inahakikisha kwamba seli huunda pellet iliyo chini ya bomba la centrifuge.
● Umuhimu wa pelleting sahihi
Kuweka sahihi ni muhimu kutenganisha seli kutoka kwa ukuaji wa kati na vifaa vingine vya mumunyifu. Pellet iliyoundwa vizuri hufanya hatua za baadaye kuwa rahisi na bora zaidi, kuhakikisha upotezaji mdogo wa seli na, kwa hivyo, mavuno ya kiwango cha juu cha DNA.
Kuondolewa kwa supernatant
● Mbinu za kuondolewa kwa nguvu
Mara tu seli zitakapowekwa, supernatant (kioevu juu ya pellet) lazima iondolewe kwa uangalifu bila kuvuruga pellet ya seli. Hii kawaida hufanywa kwa kutumia micropipette. Ni muhimu kutekeleza hatua hii kwa uangalifu ili kuzuia kupoteza seli yoyote.
● Kuhakikisha upotezaji mdogo wa pellet ya seli
Kuhakikisha upotezaji mdogo wa pellet ya seli ni pamoja na bomba la uangalifu na, ikiwa ni lazima, raundi nyingi za centrifugation na kuondolewa kwa nguvu. Lengo ni kuweka seli nyingi iwezekanavyo kwenye pellet kwa uokoaji wa kiwango cha juu cha DNA.
Kuongezewa kwa suluhisho la lysis ya kiini
● Vipengele vya suluhisho la lysis ya kiini
Suluhisho la lysis ya kiini kawaida huwa na sabuni (kama SDS), buffer (kama Tris - HCl), na wakala wa chelating (kama EDTA). Sabuni inasumbua membrane ya seli na bahasha ya nyuklia, ikitoa yaliyomo ya rununu, pamoja na DNA, kwenye suluhisho.
● Jukumu la kuvunja ukuta wa seli
Suluhisho la lysis ya kiini sio tu hupunguza membrane ya seli lakini pia inaangazia protini na lipids, kuvunja kwa ufanisi kuta za seli na bahasha za nyuklia ili kutolewa DNA kwenye suluhisho.
Resuspension ya seli
● Upole wa bomba ili kuzuia kukata nywele kwa DNA
Mara tu suluhisho la lysis ya kiini linapoongezwa, seli zinahitaji kusasishwa kwa upole ili kuepusha shearing ya DNA. Kukanyaga kunaweza kuvunja DNA kuwa vipande vidogo, ambavyo vinaweza kuwa shida kwa matumizi ya chini ya maji ambayo yanahitaji juu - Masi - Uzito DNA.
● Kuhakikisha utaftaji kamili
Kusisitiza kamili kunahakikisha kwamba seli zote zinafungiwa kwa usawa, huongeza ahueni ya DNA. Hii inaweza kupatikana kwa bomba laini au kuweka suluhisho kwa kasi ya chini.
Incubation kwa seli za Lyse
● Mipangilio ya joto kwa incubation
Seli zilizosafishwa hutolewa kwa joto fulani ili kuhakikisha kuwa kamili. Hii kawaida hufanywa kwa 37 ° C hadi 55 ° C. Joto halisi na muda unaweza kutofautiana kulingana na itifaki na mahitaji maalum ya kitengo cha kutengwa cha DNA kinachotumika.
● Muda unaohitajika kwa lysis bora
Muda wa kawaida wa incubation ni kati ya dakika 20 hadi 30, lakini inaweza kubadilishwa kulingana na ufanisi wa uchunguzi wa seli uliozingatiwa. Incubation ya muda mrefu inaweza kuwa muhimu kwa uchunguzi kamili lakini inapaswa kuwa sawa dhidi ya hatari ya uharibifu wa DNA.
Baridi kwa joto la kawaida
● Umuhimu wa baridi ya polepole
Baada ya incubation, lysate hutiwa hatua kwa hatua kwa joto la kawaida. Baridi ya polepole husaidia katika kuleta utulivu wa DNA na kupunguza hatari ya mshtuko wa mafuta, ambayo inaweza kudhoofisha DNA.
● Athari kwenye DNA na uchafu wa seli
Baridi kwa joto la kawaida inaruhusu uchafu wa seli kuteremka, na kuifanya iwe rahisi kutenganisha DNA katika hatua zinazofuata. Hii pia husaidia kuleta utulivu wa shughuli za enzyme na kuwezesha kuondolewa kwa RNA na matibabu ya RNase.
Kuongezewa kwa suluhisho la RNase
● Kusudi la RNase katika utaratibu
Suluhisho la RNase linaongezwa ili kudhoofisha RNA, ambayo inaweza kushirikiana - kusafisha na DNA na kuingilia kati na matumizi ya chini ya maji. RNase huchagua RNA kwa hiari, ikiacha DNA intact.
● Kuzuia uchafuzi wa RNA
Kuzuia uchafuzi wa RNA ni muhimu kwa matumizi ambayo yanahitaji DNA safi, kama PCR na mpangilio. Matibabu ya RNase inahakikisha kwamba DNA ya pekee haina uchafu kutoka kwa uchafu wa RNA.
Utakaso wa DNA
● Njia za kutenganisha DNA kutoka kwa vifaa vingine vya rununu
Njia kadhaa zinaweza kutumika kusafisha DNA kutoka kwa lysate. Hii ni pamoja na phenol - uchimbaji wa chloroform, ethanol precipitation, na kutumia vifaa vya kibiashara vya E. coli DNA. Kila njia ina faida na hasara zake, na vifaa vya kibiashara vinatoa urahisi na matokeo thabiti.
● Kuzingatia usafi wa DNA
Usafi ni jambo muhimu kwa mafanikio ya matumizi ya chini ya maji. Kits za kibiashara, kama vile tiba ya seli E. coli DNA Kit, imeundwa kutoa kiwango cha juu - usafi wa DNA kwa kuondoa protini, lipids, na uchafu mwingine.
Hifadhi na utunzaji wa DNA iliyotengwa
● Mazoea bora ya kuhifadhi DNA
Mara tu ikiwa imetakaswa, DNA inapaswa kuhifadhiwa kwenye buffer inayofaa, kama buffer ya TE, saa - 20 ° C au - 80 ° C kwa muda mrefu - uhifadhi wa muda. Epuka kufungia mara kwa mara - mizunguko ya thaw kwani inaweza kusababisha uharibifu wa DNA.
● Kudumisha uadilifu wa DNA kwa matumizi ya chini ya maji
Ili kudumisha uadilifu wa DNA, tumia kuzaa, nuc tafadhali - zilizopo za bure na suluhisho. Hii inahakikisha kwamba DNA inabaki haifai na inafaa kwa matumizi kama vile cloning, mpangilio, na PCR.
KuhusuBluekit
Jiangsu Hillgene alianzisha makao yake makuu (mimea 10,000 ya GMP na kituo cha R&D) huko Suzhou, iliyoko Wilaya ya Wuzhong, Suzhou, mji wa Lakeshore wa Ziwa nzuri la Taihu, na maeneo mawili ya utengenezaji huko Shenzhen na Shanghai, kupanua mtandao wake wa utengenezaji wa mtandao. Wavuti ya North Carolina huko Amerika kwa sasa inajengwa, inaeneza zaidi uwepo wake wa ulimwengu. Hillgene imeunda njia ya wazi ya kukuza bidhaa za tiba ya seli, kutoka kwa ugunduzi hadi utoaji, na majukwaa ya utengenezaji wa asidi ya kiini, seramu - kusimamishwa kwa bure, maendeleo ya mchakato uliofungwa, na upimaji wa QC. Bidhaa za BlueKit zimeundwa kwa udhibiti wa ubora, kuhakikisha mafanikio ya uvumbuzi wa tiba ya rununu.
Wakati wa Posta: 2024 - 09 - 05 14:47:03
