Isolering av DNA från E. coli är ett grundläggande förfarande inom molekylärbiologi. Den här artikeln kommer att leda dig genom hela processen, ge detaljerade steg och förklaringar, vilket säkerställer att du förstår både vetenskapen och de praktiska aspekterna av förfarandet. Oavsett om du är en erfaren forskare eller en nykomling i labbet, kommer den här guiden att vara en värdefull resurs.
Förberedelse av cellupphängning
● Insamling av E. coli -celler
Det första steget i isolering av DNA från E. coli involverar att samla bakteriecellerna. Detta kräver vanligtvis växande E. coli i ett lämpligt flytande medium tills det når den logaritmiska tillväxtfasen. Tidpunkten är avgörande eftersom celler i denna fas är mest livskraftiga och lättare att lysa, vilket kommer att resultera i högre DNA -utbyte.
● Återsuspenderande celler i en lämplig buffert
Uppsamlade celler återsuspenderas sedan i en lämplig buffert. Ett vanligt val är en Tris - EDTA (TE) -buffert, som hjälper till att upprätthålla DNA: s integritet under extraktionsprocessen. Bufferten tjänar flera syften: den stabiliserar pH, kelaterna divalent katjoner som annars kan försämra DNA och ger en optimal jonisk miljö för efterföljande enzymatiska reaktioner.
Centrifugering till pelletsceller
● Parametrar för centrifugering (hastighet och tid)
Efter att ha återsuspenderat cellerna utsätts suspensionen för centrifugering för att pelletera cellerna. Centrifugeringshastighet och tid är kritiska parametrar. Vanligtvis utförs centrifugering vid cirka 4 000 - 6 000 g under 10 - 15 minuter vid 4 ° C. Detta säkerställer att cellerna bildar en snäv pellet i botten av centrifugröret.
● Betydelsen av korrekt pelletering
Korrekt pelletering är avgörande för att separera cellerna från tillväxtmediet och andra lösliga komponenter. En välformad pellet gör de efterföljande stegen enklare och effektivare, vilket säkerställer minimal förlust av celler och därför maximalt DNA -utbyte.
Avlägsnande av supernatant
● Tekniker för borttagning av supernatant
När cellerna är pelleterade måste supernatanten (vätskan ovanför pelleten) försiktigt avlägsnas utan att störa cellpelleten. Detta görs vanligtvis med en mikropipett. Det är avgörande att utföra detta steg noggrant för att undvika att förlora några celler.
● Säkerställa minimal förlust av cellpellet
Att säkerställa minimal förlust av cellpelleten innebär noggrann pipettering och vid behov flera omgångar av centrifugering och avlägsnande av supernatant. Målet är att hålla så många celler som möjligt i pelleten för maximal DNA -återhämtning.
Tillsats av kärnlyslösning
● Komponenter i kärnlyslösning
Nuclei -lyslösningen innehåller vanligtvis ett tvättmedel (som SDS), en buffert (såsom Tris - HCl) och ett kelaterande medel (som EDTA). Detergentet stör cellmembranet och kärnhöljet och släpper det cellulära innehållet, inklusive DNA, i lösningen.
● Roll i att bryta ner cellväggar
Kärnlyslösningen lyser inte bara cellmembranet utan denaturerar också proteiner och lipider, vilket effektivt bryter ner cellväggarna och kärnhöljen för att frigöra DNA i lösningen.
Resuspension av celler
● Mild pipettering för att undvika DNA -klippning
När kärnlyslösningen har lagts till måste cellerna återsuspenderas försiktigt för att undvika DNA -klippning. Skjuvning kan bryta DNA i mindre fragment, vilket kan vara problematiskt för nedströmsapplikationer som kräver hög - Molekylär - Vikt -DNA.
● Säkerställa fullständig resuspension
Fullständig resuspension säkerställer att alla celler är lyserade enhetligt och maximerar DNA -återhämtning. Detta kan uppnås genom mild pipettering eller virvel av lösningen med låg hastighet.
Inkubation till lysceller
● Temperaturinställningar för inkubation
De återsuspenderade cellerna inkuberas vid en specifik temperatur för att säkerställa fullständig lysering. Detta görs vanligtvis vid 37 ° C till 55 ° C. Den exakta temperaturen och varaktigheten kan variera beroende på protokollet och de specifika kraven för DNA -isoleringssatsen som används.
● Varaktighet som krävs för effektiv lys
Den typiska varaktigheten för inkubation är mellan 20 till 30 minuter, men den kan justeras baserat på effektiviteten för observerad celllys. Långvarig inkubation kan vara nödvändig för fullständig lysering men bör balanseras mot risken för DNA -nedbrytning.
Kylning till rumstemperatur
● Betydelsen av gradvis kylning
Efter inkubation kyls lysatet gradvis till rumstemperatur. Gradvis kylning hjälper till att stabilisera DNA och minimera risken för termisk chock, vilket potentiellt kan försämra DNA.
● Effekter på DNA och cellulärt skräp
Kylning till rumstemperatur gör det möjligt för cellulära skräp att fälla ut, vilket gör det lättare att separera DNA i de efterföljande stegen. Detta hjälper också till att stabilisera enzymaktiviteterna och underlätta avlägsnande av RNA genom RNase -behandling.
Tillsats av RNase -lösning
● Syftet med RNase i proceduren
RNase -lösning läggs till för att försämra RNA, som annars skulle kunna rena med DNA och störa nedströmsapplikationer. RNase smälter selektivt RNA och lämnar DNA intakt.
● Förhindra RNA -förorening
Att förhindra RNA -förorening är avgörande för applikationer som kräver rent DNA, såsom PCR och sekvensering. RNase -behandlingen säkerställer att det isolerade DNA är fritt från RNA -föroreningar.
Rening av DNA
● Metoder för att separera DNA från andra cellulära komponenter
Flera metoder kan användas för att rena DNA från lysatet. Dessa inkluderar fenol - kloroform extraktion, etanolutfällning och med användning av kommersiella E. coli -DNA -satser. Varje metod har sina för- och nackdelar, med kommersiella satser som erbjuder bekvämlighet och konsekventa resultat.
● Överväganden för DNA -renhet
Renhet är en kritisk faktor för framgången för nedströmsapplikationer. Kommersiella satser, såsom cellterapi E. coli DNA -kit, är utformade för att ge högt - renhet -DNA genom att effektivt ta bort proteiner, lipider och andra föroreningar.
Lagring och hantering av isolerat DNA
● Bästa metoder för lagring av DNA
När den har renats ska DNA förvaras i en lämplig buffert, som TE -buffert, vid - 20 ° C eller - 80 ° C för lång - Term lagring. Undvik ofta frysning - Tinacykler eftersom de kan orsaka DNA -nedbrytning.
● Att upprätthålla DNA -integritet för nedströmsapplikationer
För att upprätthålla DNA -integritet använder du steril, nukleas - Gratis rör och lösningar. Detta säkerställer att DNA förblir okontaminerat och lämpligt för applikationer som kloning, sekvensering och PCR.
OmBlåsakit
Jiangsu Hillgene etablerade sitt huvudkontor (10.000㎡ GMP -anläggningar och FoU -centrum) i Suzhou, beläget i Wuzhong -distriktet, Suzhou, en Lakeshore City of the Beautiful Taihu -sjön, och två tillverkningsplatser i Shenzhen och Shanghai, som utvidgar sitt tillverkning av tillverkning av land. North Carolina -webbplatsen i USA är för närvarande under uppbyggnad och sprider ytterligare sin globala närvaro. Hillgene har byggt en uttrycklig väg för att utveckla cellulära terapiprodukter, från upptäckt till leverans, med plattformar för nukleinsyratillverkning, serum - Gratis suspensionskultur, stängd processutveckling och QC -testning. Bluekit -produkter är designade för kvalitetskontroll, vilket säkerställer framgången för innovationer av cellterapi.
Inläggstid: 2024 - 09 - 05 14:47:03
