Изолирање ДНК из Е. цоли је основни поступак молекуларне биологије. Овај чланак ће вас прошетати кроз целокупни процес, пружајући детаљне кораке и објашњења, осигуравајући да разумете и науку и практичне аспекте поступка. Да ли сте искусни истраживач или придошлица лабораторију, овај водич ће бити вредан ресурс.
Припрема суспензије ћелије
● Збирка Е. цоли ћелија
Први корак у изолацији ДНК из Е. цоли укључује прикупљање бактеријских ћелија. То обично захтева растући Е. цоли у одговарајућем течном медијуму док не достигне фазу логаритамског раста. Време је пресудно јер су ћелије у овој фази најбржа и лакша за Лисе, што ће резултирати вишим приносом ДНК.
● Ћулије ћелија у одговарајућем пуферу
Сакупљене ћелије се затим ресуспендирају у погодном пуферу. Чест избор је Трис - ЕДТА (ТЕ) пуфер који помаже у одржавању интегритета ДНК током процеса екстракције. Тампон служи вишеструке сврхе: стабилизује пХ, хелат дивилантне катионе које би иначе могло разградити ДНК и пружа оптимално јонско окружење за наредне ензимске реакције.
Центрифугирање до ћелија пелета
● Параметри за центрифугирање (брзина и време)
Након поновног суспендирања ћелија, суспензија је подвргнута центрифугирању да би се ћелије пелета. Брзина и време центрифугирање су критични параметри. Обично се центрифугирање врши на око 4.000 - 6.000 г за 10 - 15 минута на 4 ° Ц. Ово осигурава да ћелије формирају уски пелет на дну цеви центрифуге.
● Важност правилног пелетирања
Правилно пелетирање је од суштинског значаја за раздвајање ћелија из средње и друге растворљиве компоненте. Добро формирани пелет олакшава и ефикаснији кораци, обезбеђујући минималан губитак ћелија и, дакле, максимални принос ДНК.
Уклањање супернатаната
● Технике уклањања супернатантног
Једном када су ћелије пелетиране, супернатант (течност изнад пелета) мора се пажљиво уклонити без ометања ћелијског пелета. То се обично ради помоћу микропипете. Кључно је да се овај корак изводи пажљиво да не изгубите било какве ћелије.
● Осигуравање минималног губитка ћелијске пелете
Осигуравање минималног губитка ћелијске пелете укључује пажљиво пипетирање и, ако је потребно, више кругова центрифугирања и уклањања супернатаната. Циљ је држати што више ћелија у пелету за максимални опоравак ДНК.
Додавање раствора језгра на језгра
● Компоненте раствора Нуцлеи Лизе
Раствор језгра обично садржи детерџент (попут СДС-а), пуфера (као што је Трис - ХЦл) и хелациони агенс (попут ЕДТА). Детерџент поремети ћелијску мембрану и нуклеарну коверту, ослобађајуће ћелијске садржаје, укључујући ДНК, у решење.
● Улога у пробијању ћелијских зидова
Раствор језгра не само да лизира ћелијску мембрану, већ и денаризује протеине и липиде, ефективно разбијајући ћелијске зидове и нуклеарне коверте да би се ДНК пустио у решење.
Ресуспензија ћелија
● Њежно пиво да бисте избегли ДНК Скинг
Једном када се додаје раствор за лизу на нуклеима, ћелије морају лагано поново суспендовати како би се избегли Скинг ДНК. Сцеарсинг може прекинути ДНК у мање фрагменте, који могу бити проблематични за низводне апликације које захтевају високу - молекуларну - ДНК на тежини.
● Осигуравање потпуног ресуспензије
Комплетно ресуспензија осигурава да су све ћелије уједначене равномерно, максимизирање опоравка ДНК. То се може постићи нежно пипетирање или вртложење раствора на ниској брзини.
Инкубација до ћелија Лисе
● Подешавања температуре за инкубацију
Ресуспендиране ћелије се инкубирају на одређеној температури како би се осигурала потпуна лиза. То се обично врши на 37 ° Ц до 55 ° Ц. Тачна температура и трајање могу се разликовати у зависности од протокола и специфичним захтевима ДНК и изолационог комплета за изолацију.
● Трајање потребан за ефикасну лизу
Типично трајање инкубације је између 20 до 30 минута, али може се подесити на основу ефикасности примећене ћелијске лизе. Дуготрајна инкубација може бити неопходна за потпуну лизу, али треба да буде уравнотежена од ризика деградације ДНК.
Хлађење до собне температуре
● Важност постепеног хлађења
Након инкубације, лизат се постепено охлади до собне температуре. Постепено хлађење помаже у стабилизацији ДНК и минимизира ризик од топлотног удара, који би потенцијално могло да разграђује ДНК.
● Ефекти на ДНК и ћелијске крхотине
Хлађење до собне температуре омогућава да се ћелијским крхотинама престане, олакшавајући одвојити ДНК у наредним корацима. Ово такође помаже у стабилизацији активности ензима и олакшава уклањање РНК-а РНасе третман.
Додавање раствора РНасе
● Сврха Рнасе у поступку
Раствор РНасе је додат у Деграде РНА, што би иначе могао да се пречисти са ДНК и ометају се у низводној апликацијама. Рнасе селективно варење РНА, остављајући ДНК нетакнут.
● Спречавање контаминације РНА
Спречавање контаминације РНА је пресудно за апликације које захтевају чисту ДНК, као што су ПЦР и секвенцирање. Третман РНсе осигурава да је изолована ДНК слободна од контаминаната РНА.
Пречишћавање ДНК
● Методе за одвајање ДНК из других ћелијских компоненти
Неколико метода се може користити за прочишћавање ДНК из лисате. Они укључују фенол - екстракцију хлороформа, падавине етанола и користећи комерцијални Е. цоли ДНК сетови. Свака метода има своје предности и недостатке, са комерцијалним комплетом који нуде практичност и доследне резултате.
● Разматрања за чистоћу ДНК
Чистоћа је критични фактор успеха низводне апликације. Комерцијални сетови, попут ћелијске терапије Е. цоли ДНК кит, дизајнирани су да дају високу ДНК чистоће ефикасно уклањањем протеина, липида и других контаминаната.
Складиштење и руковање изолованим ДНК
● Најбоље праксе за чување ДНК
Једном је пречишћено, ДНК би требало да буде сачувана у погодном пуферу, попут ТЕ пуфера, на 20 ° Ц или - 80 ° Ц за дугорочно складиштење. Избегавајте честе замрзавање - отапања циклуса јер могу проузроковати деградацију ДНК.
● Одржавање ДНК интегритета за низводне апликације
Да бисте одржали интегритет ДНК, користите стерилне, нуклеарске - бесплатне цеви и решења. Ово осигурава да ДНК остане неуротаминирана и погодна за апликације као што су клонирање, секвенцирање и ПЦР.
О томеБлуекит
Јиангсу Хиллгене је основао седиште (10.000 ° ГМП биљке и истраживање и истраживање и развој и истраживање и развој, Смештен у округу Вузхонг, Сузхоу, ЛакеСхоре Цитију прелепог Таиху језера и две производне странице у Шенжен и Шангају, који су проширили своју производну мрежу у Шенженству и Шангају. Сјеверна Царолина сајт у САД-у је тренутно у изградњи, који даље шири своје глобално присуство. Хиллгене је изградио експресни пут за развој производа ћелијске терапије, од открића до испоруке, са платформама за производњу нуклеинске киселине, серумом - бесплатног културу суспензије, развоја затвореног процеса и КЦ тестирање. БлуеКит производи дизајнирани су за контролу квалитета, осигуравајући успех иновација ћелијске терапије.
Време: 2024 - 09 - 05 14:47:03
