Izolimi i ADN -së nga E. coli është një procedurë themelore në biologjinë molekulare. Ky artikull do t'ju përshkojë tërë procesin, duke siguruar hapa dhe shpjegime të hollësishme, duke siguruar që të kuptoni si shkencën ashtu edhe aspektet praktike të procedurës. Pavarësisht nëse jeni një studiues me përvojë ose një i porsaardhur në laborator, ky udhëzues do të jetë një burim i vlefshëm.
Përgatitja e pezullimit të qelizave
● Mbledhja e qelizave E. coli
Hapi i parë në izolimin e ADN -së nga E. coli përfshin mbledhjen e qelizave bakteriale. Kjo zakonisht kërkon rritjen e E. coli në një medium të përshtatshëm të lëngshëm derisa të arrijë në fazën e rritjes logaritmike. Koha është thelbësore sepse qelizat në këtë fazë janë më të zbatueshme dhe më të lehta për tu lyer, gjë që do të rezultojë në rendiment më të lartë të ADN -së.
Cells Qelizat e ringjalljes në një tampon të përshtatshëm
Qelizat e mbledhura më pas rivendosen në një tampon të përshtatshëm. Një zgjedhje e zakonshme është një tampon tris - edta (TE), i cili ndihmon në ruajtjen e integritetit të ADN -së gjatë procesit të nxjerrjes. Buferi shërben për qëllime të shumta: ai stabilizon pH, chelates kationet divalente të cilat përndryshe mund të degradojnë ADN -në, dhe siguron një mjedis optimal jonik për reaksionet e mëvonshme enzimatike.
Centrifugimi në qelizat e peletit
● Parametrat për centrifugimin (shpejtësia dhe koha)
Pas rivendosjes së qelizave, pezullimi i nënshtrohet centrifugimit për të grumbulluar qelizat. Shpejtësia dhe koha e centrifugimit janë parametra kritikë. Në mënyrë tipike, centrifugimi kryhet në rreth 4,000 - 6,000 g për 10 - 15 minuta në 4 ° C. Kjo siguron që qelizat të formojnë një topth të ngushtë në fund të tubit të centrifugës.
● Rëndësia e peletimit të duhur
Peleting i duhur është thelbësor për të ndarë qelizat nga mediumi i rritjes dhe përbërësit e tjerë të tretshëm. Një peleti i formuar pus - i formuar i bën hapat e mëvonshëm më të lehtë dhe më efikas, duke siguruar humbje minimale të qelizave dhe, për rrjedhojë, rendimentin maksimal të ADN -së.
Heqja e supernatantit
● Teknika për heqjen e supernatantit
Pasi qelizat të grumbullohen, supernatanti (lëngu mbi fishekë) duhet të hiqet me kujdes pa prishur topthin e qelizës. Kjo zakonisht bëhet duke përdorur një mikropipetë. Crucialshtë thelbësore për të kryer këtë hap në mënyrë të përpiktë për të shmangur humbjen e ndonjë qelize.
● Sigurimi i humbjes minimale të peletit të qelizave
Sigurimi i humbjes minimale të peletit të qelizave përfshin pipetim të kujdesshëm dhe, nëse është e nevojshme, raunde të shumta të centrifugimit dhe heqjes së supernatantit. Qëllimi është të mbash sa më shumë qeliza të jetë e mundur në fishekë për rikuperimin maksimal të ADN -së.
Shtimi i zgjidhjes së lizës së bërthamave
● Përbërësit e zgjidhjes së lizës së bërthamave
Zgjidhja e lizës së bërthamave zakonisht përmban një pastrues (si SDS), një tampon (siç është Tris - HCl) dhe një agjent chelating (si EDTA). Pastruesi prish membranën qelizore dhe zarfin bërthamor, duke lëshuar përmbajtjen qelizore, përfshirë ADN -në, në zgjidhje.
● Roli në prishjen e mureve të qelizave
Zgjidhja e lizës së bërthamave jo vetëm që lizon membranën qelizore, por gjithashtu denaturon proteinat dhe lipidet, duke prishur në mënyrë efektive muret e qelizave dhe zarfet bërthamore për të lëshuar ADN -në në zgjidhje.
Resuzionimi i qelizave
● Pipetët e butë për të shmangur qethjen e ADN -së
Pasi të shtohet zgjidhja e lizës së bërthamave, qelizat duhet të rivendosen butësisht për të shmangur qethjen e ADN -së. Qearing mund të thyejë ADN -në në fragmente më të vogla, të cilat mund të jenë problematike për aplikimet në rrjedhën e poshtme që kërkojnë të larta - molekulare - ADN me peshë.
● Sigurimi i ringjalljes së plotë
Resuzionimi i plotë siguron që të gjitha qelizat të lizohen në mënyrë të njëtrajtshme, duke maksimizuar rikuperimin e ADN -së. Kjo mund të arrihet me tubacione të buta ose duke vorbulluar zgjidhjen me një shpejtësi të ulët.
Inkubacioni në qelizat Lyse
Setts Cilësimet e temperaturës për inkubacion
Qelizat e rivendosura inkubohen në një temperaturë specifike për të siguruar lizën e plotë. Kjo zakonisht bëhet në 37 ° C deri 55 ° C. Temperatura dhe kohëzgjatja e saktë mund të ndryshojnë në varësi të protokollit dhe kërkesave specifike të kompletit të izolimit të ADN -së.
● Kohëzgjatja e nevojshme për lizë efektive
Kohëzgjatja tipike për inkubacion është midis 20 deri në 30 minuta, por mund të rregullohet bazuar në efikasitetin e lizës së qelizave të vëzhguara. Inkubacioni i zgjatur mund të jetë i nevojshëm për lizën e plotë, por duhet të jetë e ekuilibruar kundër rrezikut të degradimit të ADN -së.
Ftohja në temperaturën e dhomës
● Rëndësia e ftohjes graduale
Pas inkubacionit, lizati ftohet gradualisht në temperaturën e dhomës. Ftohja graduale ndihmon në stabilizimin e ADN -së dhe minimizon rrezikun e shokut termik, i cili mund të degradojë potencialisht ADN -në.
● Efektet në ADN dhe mbeturinat qelizore
Ftohja në temperaturën e dhomës lejon që mbeturinat qelizore të precipitojnë, duke e bërë më të lehtë ndarjen e ADN -së në hapat pasues. Kjo gjithashtu ndihmon në stabilizimin e aktiviteteve të enzimës dhe lehtëson heqjen e ARN me trajtimin RNase.
Shtimi i zgjidhjes RNase
● Qëllimi i RNase në procedurë
Zgjidhja RNase është shtuar për të degraduar ARN, e cila përndryshe mund të pastrojë me ADN -në dhe të ndërhyjë në aplikimet në rrjedhën e poshtme. RNase tretet në mënyrë selektive ARN, duke e lënë të paprekur ADN -në.
● Parandalimi i ndotjes së ARN -së
Parandalimi i ndotjes së ARN -së është thelbësore për aplikimet që kërkojnë ADN të pastër, siç janë PCR dhe sekuencat. Trajtimi RNase siguron që ADN -ja e izoluar të jetë e lirë nga ndotësit e ARN -së.
Pastrimi i ADN -së
● Metodat për ndarjen e ADN -së nga përbërësit e tjerë qelizorë
Disa metoda mund të përdoren për të pastruar ADN -në nga lizati. Këto përfshijnë fenol - nxjerrjen e kloroformës, reshjet e etanolit dhe përdorimin e kompleteve komerciale të ADN -së E. coli. Secila metodë ka të mirat dhe të këqijat e saj, me komplete tregtare që ofrojnë komoditet dhe rezultate të qëndrueshme.
● Konsiderata për pastërtinë e ADN -së
Pastërtia është një faktor kritik për suksesin e aplikacioneve në rrjedhën e poshtme. Komplete komerciale, siç është terapia e qelizave E. coli ADN, janë krijuar për të dhënë ADN të lartë - Pastërtia duke hequr në mënyrë efektive proteinat, lipidet dhe ndotësit e tjerë.
Ruajtja dhe trajtimi i ADN -së të izoluar
● Praktikat më të mira për ruajtjen e ADN -së
Pasi të pastrohet, ADN -ja duhet të ruhet në një tampon të përshtatshëm, si tampon TE, në - 20 ° C ose - 80 ° C për një kohë të gjatë - ruajtje me afat. Shmangni ngrirjen e shpeshtë - ciklet e shkrirjes pasi ato mund të shkaktojnë degradim të ADN -së.
● Ruajtja e integritetit të ADN -së për aplikimet në rrjedhën e poshtme
Për të ruajtur integritetin e ADN -së, përdorni sterile, nuklease - tuba dhe zgjidhje falas. Kjo siguron që ADN -ja të mbetet e pakontaminuar dhe e përshtatshme për aplikime të tilla si klonimi, sekuencat dhe PCR.
AfërBlu
Jiangsu Hillgene themeloi selinë e saj (10,000㎡ bimë PMP dhe qendrën R&D) në Suzhou, e vendosur në rrethin Wuzhong, Suzhou, një qytet liqenor të Liqenit të bukur Taihu, dhe dy vende prodhuese në Shenzhen dhe Shanghai, duke zgjatur rrjetin e tij të prodhimit në mbarë vendin. Zona e Karolinës së Veriut në SH.B.A. aktualisht është në ndërtim e sipër, duke përhapur më tej praninë e saj globale. Hillgene ka ndërtuar një rrugë të shprehur për zhvillimin e produkteve të terapisë qelizore, nga zbulimi në shpërndarje, me platforma për prodhimin e acideve nukleike, serumin - Kultivimi i pezullimit falas, zhvillimi i procesit të mbyllur dhe testimi i QC. Produktet Bluekit janë të dizajnuara për kontrollin e cilësisë, duke siguruar suksesin e risive të terapisë celulare.
Koha e postimit: 2024 - 09 - 05 14:47:03
