Izoliranje DNK iz E. coli je temeljni postopek v molekularni biologiji. Ta članek vas bo vodil skozi celoten postopek, ki bo zagotovil podrobne korake in razlage, s čimer boste zagotovili razumevanje tako znanosti kot praktičnih vidikov postopka. Ne glede na to, ali ste sezonski raziskovalec ali novinec v laboratoriju, bo ta vodnik dragocen vir.
Priprava celične suspenzije
● Zbiranje celic E. coli
Prvi korak pri izolaciji DNK iz E. coli vključuje zbiranje bakterijskih celic. To običajno zahteva gojenje E. coli v ustreznem tekočem mediju, dokler ne doseže logaritmične faze rasti. Čas je ključnega pomena, ker so celice v tej fazi najbolj sposobne in lažje lizirajte, kar bo povzročilo večji donos DNK.
● Resussing celice v ustreznem puferju
Zbrane celice se nato resuspendirajo v ustreznem puferju. Pogosta izbira je Tris - EDTA (TE) medpomnilnik, ki pomaga ohranjati celovitost DNK med postopkom ekstrakcije. Pufer služi več namenov: stabilizira pH, kelate dvovalentne katione, ki bi sicer lahko razgradili DNK, in zagotavlja optimalno ionsko okolje za poznejše encimske reakcije.
Centrifugiranje v celice pelete
● Parametri za centrifugiranje (hitrost in čas)
Po oživljanju celic je suspenzija podvržena centrifugiranju, da celice peleta. Hitrost in čas centrifugiranja sta ključni parametri. Običajno se centrifugiranje izvede na približno 4.000 - 6000 g za 10 - 15 minut pri 4 ° C. To zagotavlja, da celice tvorijo tesno peleto na dnu cevi za centrifugo.
● Pomen pravilnega peleta
Pravilno peleto je bistvenega pomena za ločevanje celic od rastnega medija in drugih topnih komponent. Vodnjak, oblikovana pelet, naredi naslednje korake lažje in učinkovitejše, kar zagotavlja minimalno izgubo celic in s tem največji donos DNK.
Odstranjevanje supernatanta
● Tehnike za odstranjevanje supernatanta
Ko celice peletirajo, je treba supernatant (tekočino nad peletom) previdno odstraniti, ne da bi motili celično pelet. Običajno se to naredi z mikropipeto. Ključnega pomena je, da ta korak natančno izvedemo, da ne bi izgubili celic.
● Zagotavljanje minimalne izgube celične pelete
Zagotavljanje minimalne izgube celične pelete vključuje skrbno pipettiranje in po potrebi več krogov centrifugiranja in odstranjevanja supernatanta. Cilj je ohraniti čim več celic v peletu za največje okrevanje DNK.
Dodajanje raztopine jeder
● Sestavni deli raztopine lize jeder
Raztopina lize nuklei običajno vsebuje detergent (kot SDS), pufer (na primer Tris - HCl) in kelacijsko sredstvo (kot EDTA). Detergent moti celično membrano in jedrsko ovojnico in sprošča celično vsebino, vključno z DNK, v raztopino.
● Vloga pri razbijanju celičnih sten
Raztopina lize Nuclei ne samo lizira celično membrano, ampak tudi denaturira beljakovine in lipide, kar učinkovito razgradi celične stene in jedrske ovojnice, da sprosti DNK v raztopino.
Resuspekcija celic
● Nežno pipettiranje, da se prepreči striženje DNK
Ko dodamo raztopino lize jeder, je treba celice nežno oživiti, da se prepreči striženje DNK. Striženje lahko razbije DNK na manjše fragmente, kar je lahko problematično za nižje aplikacije, ki zahtevajo visoko - molekularno - teže DNK.
● Zagotavljanje popolne resuspenzije
Popolna resuspenzija zagotavlja, da so vse celice enakomerno lizirane, kar maksimira okrevanje DNK. To je mogoče doseči z nežnim pipettiranjem ali vrtincem raztopine z nizko hitrostjo.
Inkubacija v lise celice
● Nastavitve temperature za inkubacijo
Resuspendirane celice se inkubirajo pri določeni temperaturi, da se zagotovi popolna liza. Običajno se to naredi pri 37 ° C do 55 ° C. Natančna temperatura in trajanje se lahko razlikujeta glede na protokol in specifične zahteve, ki se uporabljata izolacijska komplet DNK.
● Trajanje, potrebno za učinkovito lizo
Tipično trajanje inkubacije je od 20 do 30 minut, vendar ga je mogoče prilagoditi na podlagi učinkovitosti opažene celične lize. Dolgotrajna inkubacija je morda potrebna za popolno lizo, vendar jo je treba uravnotežiti s tveganjem za razgradnjo DNK.
Hlajenje na sobno temperaturo
● Pomen postopnega hlajenja
Po inkubaciji se lizat postopoma ohladi na sobno temperaturo. Postopno hlajenje pomaga pri stabilizaciji DNK in zmanjšuje tveganje za toplotni šok, kar lahko potencialno razgradi DNK.
● Vpliv na DNK in celične naplavine
Hlajenje na sobno temperaturo omogoča, da se celični odpadki oborijo, kar olajša ločitev DNK v naslednjih korakih. To pomaga tudi pri stabilizaciji encimskih aktivnosti in olajša odstranitev RNA z zdravljenjem z RNazo.
Dodajanje raztopine RNase
● Namen RNaze v postopku
Raztopino RNaze dodamo razgradnjo RNA, ki bi lahko sicer lahko očistila z DNK in motila na nižji uporabi. RNase selektivno prebavi RNA, pri čemer DNK ostane nedotaknjen.
● Preprečevanje kontaminacije RNA
Preprečevanje kontaminacije RNA je ključnega pomena za aplikacije, ki zahtevajo čisto DNK, kot sta PCR in zaporedje. Obdelava RNaze zagotavlja, da izolirana DNK ne vsebuje onesnaževal RNA.
Čiščenje DNK
● Metode za ločevanje DNK od drugih celičnih komponent
Za čiščenje DNK iz lizata lahko uporabimo več metod. Sem spadajo ekstrakcija fenola - kloroform, padavine etanola in uporaba komercialnih kompletov DNA E. coli. Vsaka metoda ima svoje prednosti in slabosti, komercialni kompleti pa ponujajo udobje in dosledne rezultate.
● Upoštevati čistost DNK
Čistost je ključni dejavnik za uspeh aplikacij na nižji stopnji. Komercialni kompleti, kot je celična terapija E. coli DNA komplet, so zasnovani tako, da dobijo visoko - čistost DNK z učinkovito odstranjevanjem beljakovin, lipidov in drugih onesnaževal.
Skladiščenje in ravnanje z izolirano DNK
● Najboljše prakse za shranjevanje DNK
Ko je očiščena, je treba DNK shranjevati v ustreznem puferju, kot je TE pufer, pri - 20 ° C ali - 80 ° C za dolgo - shranjevanje. Izogibajte se pogostim zamrzovalnim - odtajenim cikli, saj lahko povzročijo razgradnjo DNK.
● Vzdrževanje celovitosti DNK za nižje aplikacije
Za ohranitev celovitosti DNK uporabite sterilno, nukleazo - proste cevi in rešitve. To zagotavlja, da DNK ostane nekontaminirana in primerna za aplikacije, kot so kloniranje, zaporedje in PCR.
PribližnoBluekit
Jiangsu Hillgene je v Suzhouju, ki se nahaja v okrožju Wuzhong, v Suzhouju, v mestu Lekeshore v čudovitem jezeru Taihu, in na dveh proizvodnih mestih v Shenzhenu in Shanghaiju, razširil svojo proizvodno mrežo v državi, v okrožju Wuzhong, v Shenzhen in Shanghai, ustanovil svoj sedež (10.000㎡ GMP obrat in R&D Center). Mesto Severne Karoline v ZDA je trenutno v gradnji, kar še širi svojo globalno prisotnost. Hillgene je zgradil ekspresno pot za razvoj izdelkov za celično terapijo, od odkritja do poroda, s platformami za proizvodnjo nukleinske kisline, serumsko - Prosto gojenje suspenzije, razvoj zaprtega procesa in testiranje QC. Izdelki BlueKit so zasnovani za nadzor kakovosti, kar zagotavlja uspeh inovacij celične terapije.
Čas objave: 2024 - 09 - 05 14:47:03
