Izolačná DNA z E. coli je základný postup v molekulárnej biológii. Tento článok vás prevedie celým procesom a poskytne podrobné kroky a vysvetlenia a zabezpečí, aby ste pochopili vedu a praktické aspekty postupu. Či už ste skúseným výskumným pracovníkom alebo nováčikom v laboratóriu, tento sprievodca bude cenným zdrojom.
Príprava bunkovej suspenzie
● Zbierka buniek E. coli
Prvý krok v izolačnej DNA z E. coli zahŕňa zhromažďovanie bakteriálnych buniek. Zvyčajne to vyžaduje pestovanie E. coli vo vhodnom kvapalnom médiu, až kým nedosiahne fázu logaritmického rastu. Načasovanie je rozhodujúce, pretože bunky v tejto fáze sú naj životaschopnejšie a ľahšie sa ýzujú, čo bude mať za následok vyšší výťažok DNA.
● Resuspendujúce bunky v príslušnom tlmivom roztoku
Zhromaždené bunky sa potom resuspendujú vo vhodnom pufri. Bežnou voľbou je pufer Tris - EDTA (TE), ktorý pomáha udržiavať integritu DNA počas procesu extrakcie. Túffer slúži viacerým účelom: stabilizuje pH, chelátuje dvojmocné katióny, ktoré by inak mohli degradovať DNA, a poskytuje optimálne iónové prostredie pre následné enzymatické reakcie.
Odstredivka do buniek peliet
● Parametre pre centrifugáciu (rýchlosť a čas)
Po resuspendovaní buniek je suspenzia podrobená odstredivosti na peletu buniek. Rýchlosť odstredenia a čas sú kritickými parametrami. Typicky sa odstredenie vykonáva približne 4 000 - 6 000 g počas 10 - 15 minút pri 4 ° C. To zaisťuje, že bunky tvoria tesnú peletu na spodnej časti odstredivej trubice.
● Dôležitosť správneho pelety
Správne pelety je nevyhnutné na oddelenie buniek od rastového média a iných rozpustných komponentov. Dobre vytvorená peleta uľahčuje a efektívnejšiu peletu zabezpečuje minimálnu stratu buniek, a teda maximálny výťažok DNA.
Odstránenie supernatantu
● Techniky na odstránenie supernatantu
Akonáhle sú bunky peletované, musí byť supernatant (kvapalina nad peletou) opatrne odstránený bez narušenia bunkovej pelety. Zvyčajne sa to robí pomocou mikropipiet. Je nevyhnutné vykonať tento krok starostlivo, aby sa zabránilo strate akýchkoľvek buniek.
● Zabezpečenie minimálnej straty bunkovej pelety
Zabezpečenie minimálnej straty bunkovej pelety zahŕňa starostlivé pipetovanie av prípade potreby viac kola odstredenia a odstraňovania supernatantu. Cieľom je udržať čo najviac buniek v pelete pre maximálne regeneráciu DNA.
Pridanie jadrového lýzy roztoku
● Komponenty roztoku jadrovej lýzy
Roztok jadrového lýzy zvyčajne obsahuje detergent (ako SDS), pufra (napríklad Tris - HCI) a chelatačné činidlo (napríklad EDTA). Detergent narušuje bunkovú membránu a jadrovú obálku, pričom do roztoku uvoľňuje bunkový obsah vrátane DNA.
● Úloha pri rozkladaní bunkových stien
Roztok jadrového lýzy nielen lyzácie bunkovej membrány, ale tiež denaturizuje proteíny a lipidy, čím sa účinne rozkladá bunkové steny a jadrové obálky, aby sa uvoľnila DNA do roztoku.
Resuspenzia buniek
● Jemné pipetovanie, aby sa predišlo strihu DNA
Akonáhle je roztok jadrového lýzy pridaný, musia sa bunky jemne resuspendovať, aby sa predišlo strihaniu DNA. Strih môže rozbiť DNA na menšie fragmenty, ktoré môžu byť problematické pre aplikácie po prúde, ktoré vyžadujú vysokú - molekulárnu - hmotnosť DNA.
● Zabezpečenie úplného resuspresie
Kompletná resuspenzia zaisťuje, že všetky bunky sú rovnomerne lyzované, čo maximalizuje obnovenie DNA. To sa dá dosiahnuť jemným pipetovaním alebo vírom roztokom pri nízkej rýchlosti.
Inkubácia na lýzové bunky
● Nastavenie teploty pre inkubáciu
Resuspendované bunky sa inkubujú pri špecifickej teplote, aby sa zabezpečila úplná lýza. Zvyčajne sa to robí pri 37 ° C až 55 ° C. Presná teplota a trvanie sa môžu líšiť v závislosti od protokolu a špecifických požiadaviek použitej súpravy na izoláciu DNA.
● Trvanie potrebné na účinnú lýzu
Typické trvanie inkubácie je medzi 20 až 30 minútami, ale dá sa upraviť na základe pozorovanej účinnosti bunkovej lýzy. Pre úplnú lýzu môže byť potrebná predĺžená inkubácia, ale mala by byť vyvážená s rizikom degradácie DNA.
Chladenie na izbovú teplotu
● Dôležitosť postupného chladenia
Po inkubácii sa lyzát postupne ochladí na teplotu miestnosti. Postupné chladenie pomáha pri stabilizácii DNA a minimalizuje riziko tepelného šoku, ktoré by mohlo potenciálne degradovať DNA.
● Účinky na DNA a bunkové zvyšky
Chladenie na teplotu miestnosti umožňuje zrážanie zvyškov buniek, čo uľahčuje oddelenie DNA v nasledujúcich krokoch. To tiež pomáha stabilizovať enzýmové aktivity a uľahčuje odstránenie RNA liečbou RNázy.
Pridanie RNázového roztoku
● Účel RNázy v postupe
Roztok RNázy sa pridá na degradáciu RNA, ktorá by sa inak mohla vyčistiť s DNA a interferovať s aplikáciami do následných prúdov. RNáza selektívne trávi RNA, pričom DNA ponecháva neporušenú.
● Predchádzanie kontaminácii RNA
Prevencia kontaminácie RNA je rozhodujúca pre aplikácie, ktoré vyžadujú čistú DNA, ako je PCR a sekvenovanie. Liečba RNázy zaisťuje, že izolovaná DNA je bez RNA kontaminantov.
Čistenie DNA
● Metódy na oddelenie DNA od iných bunkových zložiek
Na čistenie DNA z lyzátu sa môže použiť niekoľko metód. Patria sem extrakcia fenolu - chloroform, zrážanie etanolu a použitie komerčných súprav DNA E. coli. Každá metóda má svoje výhody a nevýhody, pričom komerčné súpravy ponúkajú pohodlie a konzistentné výsledky.
● Úvahy o čistote DNA
Čistota je kritickým faktorom pre úspech po prúde. Komerčné súpravy, ako napríklad bunková terapia E. coli DNA súpravy, sú navrhnuté tak, aby poskytovali DNA s vysokou - čistota účinným odstraňovaním proteínov, lipidov a iných kontaminantov.
Skladovanie a manipulácia s izolovanou DNA
● Osvedčené postupy na ukladanie DNA
Po čistení by sa mala DNA skladovať vo vhodnom tlmivom roztoku, ako je TE pufr, pri - 20 ° C alebo - 80 ° C na dlhodobé skladovanie. Vyhnite sa častým zmrazením cyklov rozmrazovania, pretože môžu spôsobiť degradáciu DNA.
● Udržiavanie integrity DNA pre aplikácie do následných prúdov
Na udržanie integrity DNA používajte sterilné, nukleázové trubice a riešenia. To zaisťuje, že DNA zostane nekontaminovaná a vhodná pre aplikácie, ako sú klonovanie, sekvenovanie a PCR.
OČučoriedka
Jiangsu Hillgene založil svoje sídlo (10 000 ° GMP rastliny a centrum výskumu a vývoja) v Suzhou, ktorý sa nachádza v okrese Wuzhong, Suzhou, mesto Lakeshore mesta Beautiful Taihu Lake a dve výrobné miesta v Shenzhene a Shanghai, ktorý rozširuje svoju výrobnú sieť Nationwide. Miesto Severnej Karolíny v USA je v súčasnosti vo výstavbe a ďalej šíri svoju globálnu prítomnosť. Spoločnosť Hilgene vybudovala expresnú cestu pre vývoj produktov bunkovej terapie, od objavovania po dodanie, s platformami na výrobu nukleových kyselín, sérum - bezplatná suspenzia, kultivácia uzavretých procesov a testovanie QC. Výrobky Bluekit sú navrhnuté na kontrolu kvality, čím sa zabezpečuje úspech inovácií bunkovej terapie.
Čas príspevku: 2024 - 09 - 05 14:47:03
