Izolarea ADN -ului de E. coli este o procedură fundamentală în biologia moleculară. Acest articol vă va parcurge întregul proces, oferind pași și explicații detaliate, asigurându -vă că înțelegeți atât știința, cât și aspectele practice ale procedurii. Indiferent dacă sunteți un cercetător experimentat sau un nou venit în laborator, acest ghid va fi o resursă valoroasă.
Pregătirea suspensiei celulare
● Colecția de celule E. coli
Primul pas în izolarea ADN -ului de E. coli implică colectarea celulelor bacteriene. Acest lucru necesită de obicei creșterea E. coli într -un mediu lichid adecvat până când ajunge în faza de creștere logaritmică. Momentul este crucial, deoarece celulele din această fază sunt cele mai viabile și mai ușor de lyse, ceea ce va duce la un randament mai mare al ADN -ului.
● Celulele de resuspendare într -un tampon adecvat
Celulele colectate sunt apoi resuspendate într -un tampon adecvat. O alegere comună este un tampon Tris - EDTA (TE), care ajută la menținerea integrității ADN -ului în timpul procesului de extracție. Bufferul servește mai multe scopuri: stabilizează pH -ul, chelate cationi divalenți care altfel ar putea degrada ADN -ul și oferă un mediu ionic optim pentru reacțiile enzimatice ulterioare.
Centrifugare la celulele peleților
● Parametri pentru centrifugare (viteză și timp)
După resuspendarea celulelor, suspensia este supusă centrifugării la peleți celulele. Viteza și timpul de centrifugare sunt parametri critici. De obicei, centrifugarea se efectuează la aproximativ 4.000 - 6.000 g timp de 10 - 15 minute la 4 ° C. Acest lucru asigură că celulele formează o peletă strânsă în partea de jos a tubului de centrifugă.
● Importanța peletării adecvate
Peletul adecvat este esențial pentru a separa celulele de mediul de creștere și de alte componente solubile. O peletă bine formată face etapele ulterioare mai ușoare și mai eficiente, asigurând pierderea minimă a celulelor și, prin urmare, un randament maxim de ADN.
Îndepărtarea supernatantului
● Tehnici de îndepărtare a supernatantului
Odată ce celulele sunt peletice, supernatantul (lichidul de deasupra peletei) trebuie îndepărtat cu atenție fără a deranja peletul celular. Acest lucru se face de obicei folosind o micropipetă. Este crucial să efectuați acest pas meticulos pentru a evita pierderea celulelor.
● Asigurarea pierderii minime de peleți celulari
Asigurarea pierderii minime a peletei celulare implică o pipetare atentă și, dacă este necesar, mai multe runde de centrifugare și îndepărtare supernatantă. Scopul este de a menține cât mai multe celule în peletă pentru recuperarea maximă a ADN -ului.
Adăugarea soluției de liză nuclee
● Componente ale soluției de liză nuclee
Soluția de liză nuclei conține de obicei un detergent (cum ar fi SDS), un tampon (cum ar fi Tris - HCl) și un agent de chelare (cum ar fi EDTA). Detergentul perturbă membrana celulară și plicul nuclear, eliberând conținutul celular, inclusiv ADN -ul, în soluție.
● Rolul în descompunerea pereților celulari
Soluția de liză a nucleelor nu numai că lizează membrana celulară, ci și denaturat proteinele și lipidele, descompunând efectiv pereții celulari și plicurile nucleare pentru a elibera ADN -ul în soluție.
Resuspensia celulelor
● Pipetare blândă pentru a evita forfecarea ADN -ului
Odată adăugată soluția de liză a nucleelor, celulele trebuie să fie resuspendate ușor pentru a evita forfecarea ADN -ului. Firurea poate sparge ADN -ul în fragmente mai mici, care pot fi problematice pentru aplicațiile din aval care necesită ADN cu greutate mare - moleculară.
● Asigurarea resuspensării complete
Resuspensia completă asigură că toate celulele sunt lizate uniform, maximizând recuperarea ADN -ului. Acest lucru poate fi obținut prin pipetare blândă sau vortexarea soluției la o viteză mică.
Incubare la celulele lyse
● Setări de temperatură pentru incubare
Celulele resuspendate sunt incubate la o temperatură specifică pentru a asigura liza completă. Acest lucru se face de obicei la 37 ° C până la 55 ° C. Temperatura și durata exactă pot varia în funcție de protocol și de cerințele specifice ale kitului de izolare ADN.
● Durata necesară pentru liza eficientă
Durata tipică pentru incubare este cuprinsă între 20 și 30 de minute, dar poate fi ajustată pe baza eficienței lizei celulare observate. Incubarea prelungită poate fi necesară pentru liza completă, dar ar trebui să fie echilibrată împotriva riscului de degradare a ADN -ului.
Răcire la temperatura camerei
● Importanța răcirii treptate
După incubare, lizatul este răcit treptat la temperatura camerei. Răcirea treptată ajută la stabilizarea ADN -ului și minimizează riscul de șoc termic, care ar putea degrada ADN -ul.
● Efecte asupra ADN -ului și a resturilor celulare
Răcirea la temperatura camerei permite precipitarea resturilor celulare, făcând mai ușor separarea ADN -ului în etapele ulterioare. Acest lucru ajută, de asemenea, la stabilizarea activităților enzimatice și facilitează îndepărtarea ARN prin tratamentul cu RNază.
Adăugarea soluției RNază
● Scopul RNase în procedură
Soluția RNase se adaugă la ARN degradate, care altfel ar putea să se purifice cu ADN -ul și să interfereze cu aplicațiile din aval. RNase digerează selectiv ARN, lăsând ADN -ul intact.
● Prevenirea contaminării ARN
Prevenirea contaminării ARN este crucială pentru aplicațiile care necesită ADN pur, cum ar fi PCR și secvențiere. Tratamentul cu RNază asigură că ADN -ul izolat este lipsit de contaminanți ARN.
Purificarea ADN -ului
● Metode pentru separarea ADN -ului de alte componente celulare
Mai multe metode pot fi utilizate pentru a purifica ADN -ul din lizat. Acestea includ extracția fenolului - cloroform, precipitațiile de etanol și utilizarea kiturilor comerciale de ADN E. coli. Fiecare metodă are pro și contra, kituri comerciale oferind comoditate și rezultate consistente.
● Considerații pentru puritatea ADN -ului
Puritatea este un factor critic pentru succesul aplicațiilor din aval. Trusele comerciale, cum ar fi kitul de ADN E. coli E. coli, sunt concepute pentru a produce ADN de puritate ridicată prin eliminarea eficientă a proteinelor, lipidelor și a altor contaminanți.
Depozitarea și manipularea ADN -ului izolat
● Cele mai bune practici pentru stocarea ADN -ului
Odată purificat, ADN -ul trebuie depozitat într -un tampon adecvat, cum ar fi tamponul TE, la - 20 ° C sau - 80 ° C pentru depozitarea pe termen lung. Evitați înghețarea frecventă a ciclurilor de dezgheț, deoarece pot provoca degradarea ADN -ului.
● Menținerea integrității ADN -ului pentru aplicațiile din aval
Pentru a menține integritatea ADN -ului, utilizați tuburi și soluții sterile, nucleaze - Acest lucru asigură că ADN -ul rămâne necontaminat și potrivit pentru aplicații precum clonarea, secvențarea și PCR.
DespreBluekit
Jiangsu Hillgene și -a stabilit sediul central (10.000 ㎡ plante GMP și centrul de cercetare și dezvoltare) în Suzhou, situat în districtul Wuzhong, Suzhou, un oraș Lakeshore din frumosul lac Taihu și două site -uri de producție din Shenzhen și Shanghai, extinzând rețeaua de fabricație la nivel național. Site -ul din Carolina de Nord din SUA este în prezent în construcție, răspândindu -și în continuare prezența globală. Hillgene a construit o cale expres pentru dezvoltarea produselor de terapie celulară, de la descoperire până la livrare, cu platforme pentru fabricarea acidului nucleic, cultură de suspensie gratuită, dezvoltare a procesului închis și testare QC. Produsele Bluekit sunt concepute pentru controlul calității, asigurând succesul inovațiilor terapiei celulare.
Ora post: 2024 - 09 - 05 14:47:03
