Izolowanie DNA z E. coli jest podstawową procedurą w biologii molekularnej. Ten artykuł przeprowadzi Cię przez cały proces, przedstawiając szczegółowe kroki i wyjaśnienia, zapewniając zrozumienie zarówno nauki, jak i praktycznych aspektów procedury. Niezależnie od tego, czy jesteś doświadczonym badaczem, czy nowicjuszem w laboratorium, ten przewodnik będzie cennym zasobem.
Przygotowanie zawieszenia komórkowego
● Zbieranie komórek E. coli
Pierwszy krok w izolowaniu DNA z E. coli polega na zbieraniu komórek bakteryjnych. Zwykle wymaga to wzrostu E. coli w odpowiednim ciekłym pożywce, dopóki nie osiągnie logarytmicznej fazy wzrostu. Czas ma kluczowe znaczenie, ponieważ komórki w tej fazie są najbardziej opłacalne i łatwiejsze do lizowania, co spowoduje wyższą wydajność DNA.
● Ponowne zawieszanie komórek w odpowiednim buforze
Zebrane komórki są następnie ponownie zawieszane w odpowiednim buforze. Częstym wyborem jest bufor TRIS - EDTA (TE), który pomaga utrzymać integralność DNA podczas procesu ekstrakcji. Bufor obsługuje wiele celów: stabilizuje pH, chelatuje białkowe kation, które w innym przypadku mogłyby degradować DNA, i zapewnia optymalne środowisko jonowe dla kolejnych reakcji enzymatycznych.
Wirowanie do komórek osadów
● Parametry wirowania (prędkość i czas)
Po ponownej ponownej zawartości komórek zawieszenie poddawane odwirowaniu w celu osadania komórek. Szybkość odśrodkowania i czas są parametrami krytycznymi. Zazwyczaj wirowanie odbywa się na około 4000 - 6000 g przez 10 - 15 minut w 4 ° C. Zapewnia to, że komórki tworzą ciasny osad na dnie rurki wirówki.
● Znaczenie właściwego granulowania
Właściwe granulowanie jest niezbędne do oddzielenia komórek od pożywki wzrostowej i innych rozpuszczalnych składników. Studnia - Pellet utworzony przez kolejne kroki jest łatwiejsze i bardziej wydajne, zapewniając minimalną utratę komórek, a zatem maksymalną wydajność DNA.
Usunięcie supernatantu
● Techniki usuwania supernatantów
Po granulowaniu komórek supernatant (ciecz nad granulką) musi zostać ostrożnie usunięty bez zakłócania osadu komórkowego. Zwykle odbywa się to za pomocą mikropipety. Ważne jest, aby wykonać ten krok skrupulatnie, aby uniknąć utraty jakichkolwiek komórek.
● Zapewnienie minimalnej utraty osadu komórkowego
Zapewnienie minimalnej utraty osadu komórkowego obejmuje staranne pipetowanie i, jeśli to konieczne, wiele rund wirowania i usunięcia supernatantu. Celem jest zatrzymanie jak największej liczby komórek w osadstwie w celu maksymalnego odzyskiwania DNA.
Dodanie roztworu do lizy jąder
● Składniki roztworu lizy jąder
Roztwór lizy jąder zwykle zawiera detergent (taki jak SDS), bufor (taki jak TRIS - HCl) i środek chelatujący (jak EDTA). Detergent zakłóca błonę komórkową i otoczkę jądrową, uwalniając zawartość komórkową, w tym DNA, do roztworu.
● Rola w rozkładaniu ścian komórkowych
Roztwór do lizy jąder nie tylko lizuje błonę komórkową, ale także denaturuje białka i lipidy, skutecznie rozkładając ściany komórkowe i koperty jądrowe w celu uwolnienia DNA do roztworu.
Ponowne zawieszenie komórek
● Delikatne pipetowanie, aby uniknąć ścinania DNA
Po dodaniu roztworu do lizy jądrowej komórki należy delikatnie ponownie ponownie zawieszać, aby uniknąć ścinania DNA. Tymianie może rozbić DNA na mniejsze fragmenty, co może być problematyczne dla zastosowań w dół, które wymagają DNA o wysokim - molekularnym - ciężar.
● Zapewnienie całkowitego ponownego zawieszania
Całkowite ponowne zawieszenie zapewnia, że wszystkie komórki są lizowane równomiernie, maksymalizując odzyskiwanie DNA. Można to osiągnąć poprzez delikatne pipetowanie lub wirowanie roztworu z niską prędkością.
Inkubacja do komórek Lyse
● Ustawienia temperatury do inkubacji
Komórki ponowne inkubowane są w określonej temperaturze, aby zapewnić całkowitą lizę. Zwykle odbywa się to w 37 ° C do 55 ° C. Dokładna temperatura i czas trwania mogą się różnić w zależności od protokołu i zastosowanych wymagań dotyczących zestawu izolacyjnego DNA.
● Czas trwania wymaganego do skutecznej lizy
Typowy czas inkubacji wynosi od 20 do 30 minut, ale można go dostosować na podstawie obserwowanej wydajności lizy komórkowej. Długotrwałą inkubację może być konieczna do pełnej lizy, ale powinna być zrównoważona z ryzykiem degradacji DNA.
Chłodzenie do temperatury pokojowej
● Znaczenie stopniowego chłodzenia
Po inkubacji lizat jest stopniowo chłodzony do temperatury pokojowej. Stopniowe chłodzenie pomaga w stabilizacji DNA i minimalizuje ryzyko wstrząsu cieplnego, co może potencjalnie degradować DNA.
● Wpływ na DNA i resztki komórkowe
Chłodzenie do temperatury pokojowej umożliwia wytrącanie resztek komórkowych, co ułatwia oddzielenie DNA w kolejnych etapach. Pomaga to również ustabilizować aktywność enzymu i ułatwia usuwanie RNA przez leczenie RNazy.
Dodanie roztworu RNazy
● Cel RNase w procedurze
Roztwór RNase dodaje się do degradacji RNA, który w przeciwnym razie mógłby oczyszczyć za pomocą DNA i zakłócać dalsze zastosowania. RNaza selektywnie trawia RNA, pozostawiając DNA nienaruszone.
● Zapobieganie zanieczyszczeniu RNA
Zapobieganie zanieczyszczeniu RNA ma kluczowe znaczenie dla zastosowań wymagających czystego DNA, takich jak PCR i sekwencjonowanie. Leczenie RNazy zapewnia, że izolowany DNA jest wolny od zanieczyszczeń RNA.
Oczyszczanie DNA
● Metody oddzielania DNA od innych składników komórkowych
Do oczyszczania DNA z lizatu można zastosować kilka metod. Należą do nich ekstrakcja fenolu - chloroform, wytrącanie etanolu i zastosowanie komercyjnych zestawów DNA E. coli. Każda metoda ma swoje zalety i wady, a zestawy komercyjne oferują wygodę i spójne wyniki.
● Rozważania dotyczące czystości DNA
Czystość jest kluczowym czynnikiem sukcesu niższych aplikacji. Zestawy komercyjne, takie jak Zestaw DNA E. coli E. coli, mają na celu uzyskanie DNA o wysokiej jakości - czystości poprzez skuteczne usuwanie białek, lipidów i innych zanieczyszczeń.
Przechowywanie i obsługa izolowanego DNA
● Najlepsze praktyki przechowywania DNA
Po oczyszczeniu DNA należy przechowywać w odpowiednim buforze, takim jak buforze TE, w - 20 ° C lub - 80 ° C dla długiego przechowywania. Unikaj częstego zamrażania - Cykle odwilży, ponieważ mogą powodować degradację DNA.
● Utrzymanie integralności DNA dla aplikacji niższych
Aby utrzymać integralność DNA, użyj sterylnych, nukleazy - Wolne rurki i roztwory. Zapewnia to, że DNA pozostaje niezanieczyszczone i odpowiednie do zastosowań, takich jak klonowanie, sekwencjonowanie i PCR.
OBluekit
Jiangsu Hillgene założył swoją siedzibę (10 000 ㎡ rośliny GMP i centrum badań i rozwoju) w Suzhou, położonym w dzielnicy Wuzhong w Suzhou, mieście Lakeshore pięknego jeziora Taihu oraz dwa miejsca produkcyjne w Shenzhen i Shanghai, wydłużenie sieci produkcyjnej w całym kraju. Witryna Karoliny Północnej w Stanach Zjednoczonych jest obecnie w budowie, co dodatkowo rozpowszechnia jego globalną obecność. Hillgene zbudował ekspresowy ścieżkę do opracowywania produktów terapii komórkowej, od odkrycia po dostarczenie, z platformami do produkcji kwasów nukleinowych, hodowli w surowicy - Bezpłatne zawieszenie, rozwój procesów zamkniętych i testowanie QC. Produkty Bluekit są przeznaczone do kontroli jakości, zapewniając sukces innowacji w terapii komórkowej.
Czas postu: 2024 - 09 - 05 14:47:03
