Isolerende DNA fra E. coli er en grunnleggende prosedyre i molekylærbiologi. Denne artikkelen vil lede deg gjennom hele prosessen, og gi detaljerte trinn og forklaringer, og sikre at du forstår både vitenskapen og de praktiske aspektene ved prosedyren. Enten du er en erfaren forsker eller en nykommer i laboratoriet, vil denne guiden være en verdifull ressurs.
Utarbeidelse av cellesuspensjon
● Samling av E. coli -celler
Det første trinnet med å isolere DNA fra E. coli innebærer å samle bakteriecellene. Dette krever vanligvis voksende E. coli i et passende flytende medium til det når den logaritmiske vekstfasen. Tidspunktet er avgjørende fordi celler i denne fasen er mest levedyktige og lettere å lyse, noe som vil resultere i høyere DNA -utbytte.
● Resuspending celler i en passende buffer
Samlede celler blir deretter resuspendert i en passende buffer. Et vanlig valg er en Tris - EDTA (TE) -buffer, som hjelper til med å opprettholde DNA -integriteten under ekstraksjonsprosessen. Bufferen tjener flere formål: den stabiliserer pH, chelater divalente kationer som ellers kan nedbryte DNA, og gir et optimalt ionisk miljø for påfølgende enzymatiske reaksjoner.
Sentrifugering til pelletceller
● Parametere for sentrifugering (hastighet og tid)
Etter å ha resuspendert cellene, blir suspensjonen utsatt for sentrifugering for pelleten cellene. Sentrifugeringshastighet og tid er kritiske parametere. Vanligvis utføres sentrifugering på rundt 4000 - 6000 g i 10 - 15 minutter ved 4 ° C. Dette sikrer at cellene danner en tett pellet i bunnen av sentrifugerøret.
● Betydningen av riktig pelletering
Riktig pelletering er avgjørende for å skille cellene fra vekstmediet og andre oppløselige komponenter. En brønn - dannet pellet gjør de påfølgende trinnene enklere og mer effektive, og sikrer minimalt tap av celler og derfor maksimalt DNA -utbytte.
Fjerning av supernatant
● Teknikker for fjerning av supernatant
Når cellene er pelletert, må supernatanten (væsken over pelleten) fjernes forsiktig uten å forstyrre cellepelleten. Dette gjøres vanligvis ved hjelp av en mikropipette. Det er avgjørende å utføre dette trinnet nøye for å unngå å miste celler.
● Sikre minimalt tap av cellepellet
Å sikre minimalt tap av cellepelleten innebærer nøye pipettering og om nødvendig flere runder med sentrifugering og fjerning av supernatant. Målet er å holde så mange celler som mulig i pelleten for maksimal DNA -utvinning.
Tilsetning av kjernetlyseløsning
● Komponenter i kjernen lyseløsning
Kjernen lyseløsning inneholder typisk et vaskemiddel (som SDS), en buffer (for eksempel Tris - HCl) og et chelateringsmiddel (som EDTA). Vaskemidlet forstyrrer cellemembranen og atomkonvolutten, og frigjør det cellulære innholdet, inkludert DNA, inn i løsningen.
● Rollen i å bryte ned cellevegger
Kjernen lyseløsning lyser ikke bare cellemembranen, men denaturiserer også proteiner og lipider, og bryter effektivt ned celleveggene og kjernefysiske konvolutter for å frigjøre DNA i løsningen.
Resuspensjon av celler
● Skånsom pipettering for å unngå DNA -skjæring
Når kjerne lysoppløsningen er tilsatt, må cellene resuspenderes forsiktig for å unngå DNA -skjæring. Skjæring kan dele DNAet i mindre fragmenter, noe som kan være problematisk for nedstrøms applikasjoner som krever høy - molekylær - Vekt DNA.
● Sikre fullstendig resuspensjon
Komplett resuspensjon sikrer at alle celler lyseres jevnt, og maksimerer DNA -utvinning. Dette kan oppnås ved mild pipettering eller virvlering av løsningen med lav hastighet.
Inkubasjon til lyseceller
● Temperaturinnstillinger for inkubasjon
De resuspenderte cellene blir inkubert ved en spesifikk temperatur for å sikre fullstendig lysis. Dette gjøres vanligvis ved 37 ° C til 55 ° C. Den nøyaktige temperaturen og varigheten kan variere avhengig av protokollen og de spesifikke kravene til DNA -isolasjonssettet som brukes.
● Varighet som kreves for effektiv lysis
Den typiske varigheten for inkubering er mellom 20 til 30 minutter, men den kan justeres basert på effektiviteten av cellelyser som er observert. Langvarig inkubasjon kan være nødvendig for fullstendig lysis, men bør balanseres mot risikoen for DNA -nedbrytning.
Kjøling til romtemperatur
● Betydningen av gradvis kjøling
Etter inkubering avkjøles lysatet gradvis til romtemperatur. Gradvis avkjøling hjelper til med å stabilisere DNA og minimerer risikoen for termisk sjokk, noe som potensielt kan forringe DNAet.
● Effekter på DNA og cellulært rusk
Avkjøling til romtemperatur gjør at cellulært rusk kan utfelle, noe som gjør det lettere å skille DNA i de påfølgende trinnene. Dette hjelper også til å stabilisere enzymaktivitetene og letter fjerning av RNA ved RNase -behandling.
Tillegg av RNase -løsning
● Formålet med RNase i prosedyren
RNase -løsning blir tilsatt for å nedbryte RNA, som ellers kan co - rense med DNA og forstyrre nedstrøms applikasjoner. RNase fordøyer selektivt RNA, og lar DNA intakt.
● Forebygging av RNA -forurensning
Å forhindre RNA -forurensning er avgjørende for applikasjoner som krever rent DNA, for eksempel PCR og sekvensering. RNase -behandlingen sikrer at det isolerte DNA er fritt for RNA -forurensninger.
Rensing av DNA
● Metoder for å skille DNA fra andre cellulære komponenter
Flere metoder kan brukes til å rense DNA fra lysatet. Disse inkluderer fenol - kloroformekstraksjon, etanolutfelling og bruk av kommersielle E. coli DNA -sett. Hver metode har sine fordeler og ulemper, med kommersielle sett som gir bekvemmelighet og konsistente resultater.
● Hensyn for DNA -renhet
Renhet er en kritisk faktor for å lykkes med nedstrøms applikasjoner. Kommersielle sett, for eksempel celleterapi E. coli DNA -sett, er designet for å gi høy - renhet DNA ved effektivt å fjerne proteiner, lipider og andre forurensninger.
Lagring og håndtering av isolert DNA
● Beste praksis for lagring av DNA
Når den er renset, skal DNA lagres i en passende buffer, som TE -buffer, ved - 20 ° C eller - 80 ° C for lang - terminlagring. Unngå hyppig frysing - Tine sykluser, da de kan forårsake DNA -nedbrytning.
● Opprettholde DNA -integritet for nedstrøms applikasjoner
For å opprettholde DNA -integritet, bruk sterile, nuklease - frie rør og løsninger. Dette sikrer at DNA forblir ukontaminert og egnet for applikasjoner som kloning, sekvensering og PCR.
OmBluekit
Jiangsu Hillgene etablerte hovedkvarteret (10.000 GMP -planter og FoU -senter) i Suzhou, som ligger i Wuzhong -distriktet, Suzhou, en Lakeshore -by i den vakre Taihu -innsjøen, og to produksjonssteder i Shenzhen og Shanghai, som utvidet sitt produksjonsnettverk. North Carolina -området i USA er for tiden under bygging, og sprer ytterligere sin globale tilstedeværelse. Hillgene har bygget en ekspressvei for å utvikle cellulære terapiprodukter, fra oppdagelse til levering, med plattformer for nukleinsyreproduksjon, serum - gratis suspensjonskulturering, lukket prosessutvikling og QC -testing. Bluekit -produkter er designet for kvalitetskontroll, noe som sikrer suksessen med innovasjoner i cellulær terapi.
POST TID: 2024 - 09 - 05 14:47:03
