Het isoleren van DNA van E. coli is een fundamentele procedure in de moleculaire biologie. Dit artikel zal u door het hele proces leiden en gedetailleerde stappen en uitleg bieden, ervoor zorgen dat u zowel de wetenschap als de praktische aspecten van de procedure begrijpt. Of u nu een doorgewinterde onderzoeker of een nieuwkomer in het lab bent, deze gids zal een waardevolle bron zijn.
Bereiding van celophanging
● Verzameling van E. coli -cellen
De eerste stap in het isoleren van DNA van E. coli omvat het verzamelen van de bacteriecellen. Dit vereist meestal groeiende E. coli in een geschikt vloeibaar medium totdat het de logaritmische groeifase bereikt. De timing is cruciaal omdat cellen in deze fase het meest levensvatbaar zijn en gemakkelijker te lyseren, wat zal resulteren in een hogere DNA -opbrengst.
● Reserverende cellen in een geschikte buffer
Verzamelde cellen worden vervolgens geresuspendeerd in een geschikte buffer. Een gemeenschappelijke keuze is een Tris - EDTA (TE) -buffer, die helpt bij het handhaven van de integriteit van het DNA tijdens het extractieproces. De buffer dient meerdere doeleinden: het stabiliseert de pH, chelates divalgrote kationen die anders DNA kunnen afbreken en biedt een optimale ionische omgeving voor daaropvolgende enzymatische reacties.
Centrifugatie naar pelletcellen
● Parameters voor centrifugatie (snelheid en tijd)
Na het resumpen van de cellen wordt de suspensie onderworpen aan centrifugatie om de cellen te pellet. Centrifugatiesnelheid en tijd zijn kritische parameters. Meestal wordt centrifugatie uitgevoerd op ongeveer 4.000 - 6.000 g gedurende 10 - 15 minuten bij 4 ° C. Dit zorgt ervoor dat de cellen een strakke pellet vormen aan de onderkant van de centrifugebuis.
● Belang van de juiste pelleting
Juiste pelleting is essentieel om de cellen te scheiden van het groeimedium en andere oplosbare componenten. Een goed - gevormde pellet maakt de daaropvolgende stappen gemakkelijker en efficiënter, waardoor minimaal verlies van cellen en daarom maximale DNA -opbrengst zorgt.
Verwijdering van supernatant
● Technieken voor supernatante verwijdering
Zodra de cellen zijn gepelleteerd, moet de supernatant (de vloeistof boven de pellet) zorgvuldig worden verwijderd zonder de celpellet te verstoren. Dit wordt meestal gedaan met behulp van een micropipet. Het is cruciaal om deze stap zorgvuldig uit te voeren om te voorkomen dat ze cellen verliezen.
● Zorgen voor minimaal verlies van celpellet
Zorgen voor minimaal verlies van de celpellet omvat zorgvuldige pipetting en, indien nodig, meerdere rondes van centrifugatie en supernatante verwijdering. Het doel is om zoveel mogelijk cellen in de pellet te houden voor maximaal DNA -herstel.
Toevoeging van de oplossing van kernenlysis
● Componenten van de oplossing van kernenlysis
De Nuclei Lysis -oplossing bevat typisch een wasmiddel (zoals SDS), een buffer (zoals Tris - HCl) en een chelatiemiddel (zoals EDTA). Het wasmiddel verstoort het celmembraan en de nucleaire envelop, waardoor de cellulaire inhoud, inclusief DNA, in de oplossing wordt vrijgegeven.
● Rol bij het afbreken van celwanden
De kernenlyseoplossing lyseert niet alleen het celmembraan, maar denaturiseert ook eiwitten en lipiden, waardoor de celwanden en nucleaire enveloppen effectief worden afgebroken om DNA in de oplossing af te geven.
Resuspensie van cellen
● Zachte pipetting om DNA -afscheuren te voorkomen
Zodra de kernenlysisoplossing is toegevoegd, moeten de cellen voorzichtig worden geresuspendeerd om DNA -afscheuren te voorkomen. Shearing kan het DNA in kleinere fragmenten breken, wat problematisch kan zijn voor stroomafwaartse toepassingen die hoog - moleculair - gewicht DNA vereisen.
● Zorgen voor volledige resuspensie
Volledige resuspensie zorgt ervoor dat alle cellen uniform worden gelyseerd, waardoor het DNA -herstel wordt gemaximaliseerd. Dit kan worden bereikt door de oplossing voor een zachte pipetting te pipetteren of met een lage snelheid te werven.
Incubatie aan lyse -cellen
● Temperatuurinstellingen voor incubatie
De geresuspendeerde cellen worden bij een specifieke temperatuur geïncubeerd om volledige lysis te garanderen. Dit wordt meestal gedaan bij 37 ° C tot 55 ° C. De exacte temperatuur en duur kunnen variëren, afhankelijk van het protocol en de specifieke vereisten van de gebruikte DNA -isolatiekit.
● Duur vereist voor effectieve lysis
De typische duur voor incubatie is tussen 20 en 30 minuten, maar het kan worden aangepast op basis van de efficiëntie van waargenomen cellysis. Langdurige incubatie kan nodig zijn voor volledige lysis, maar moet worden afgewogen tegen het risico op DNA -afbraak.
Koeling tot kamertemperatuur
● Het belang van geleidelijke koeling
Na incubatie wordt het lysaat geleidelijk gekoeld tot kamertemperatuur. Geleidelijke koeling helpt bij het stabiliseren van het DNA en minimaliseert het risico op thermische schok, die mogelijk het DNA kan afbreken.
● Effecten op DNA en cellulair puin
Koeling tot kamertemperatuur kan het cellulaire puin neerslaan, waardoor het gemakkelijker is om het DNA in de daaropvolgende stappen te scheiden. Dit helpt ook om de enzymactiviteiten te stabiliseren en vergemakkelijkt het verwijderen van RNA door RNase -behandeling.
Toevoeging van RNase -oplossing
● Doel van RNase in de procedure
RNase -oplossing wordt toegevoegd om RNA af te breken, dat anders kan zuiveren met het DNA en verstoren met stroomafwaartse toepassingen. RNase verteert selectief RNA, waardoor het DNA intact blijft.
● Het voorkomen van RNA -besmetting
Het voorkomen van RNA -besmetting is cruciaal voor toepassingen die zuiver DNA vereisen, zoals PCR en sequencing. De RNase -behandeling zorgt ervoor dat het geïsoleerde DNA vrij is van RNA -verontreinigingen.
Zuivering van DNA
● Methoden voor het scheiden van DNA van andere cellulaire componenten
Verschillende methoden kunnen worden gebruikt om DNA uit het lysaat te zuiveren. Deze omvatten fenol - chloroformextractie, ethanolprecipitatie en het gebruik van commerciële E. coli DNA -kits. Elke methode heeft zijn voor- en nadelen, met commerciële kits die gemak en consistente resultaten bieden.
● Overwegingen voor DNA -zuiverheid
Zuiverheid is een kritische factor voor het succes van stroomafwaartse toepassingen. Commerciële kits, zoals de Celtherapie E. Coli DNA -kit, zijn ontworpen om DNA met een hoog - zuiverheid op te leveren door eiwitten, lipiden en andere verontreinigingen effectief te verwijderen.
Opslag en behandeling van geïsoleerd DNA
● Best practices voor het opslaan van DNA
Eenmaal gezuiverd, moet DNA worden opgeslagen in een geschikte buffer, zoals TE -buffer, bij - 20 ° C of - 80 ° C voor lange opslag. Vermijd frequente bevriezen - Dooi cycli omdat ze DNA -afbraak kunnen veroorzaken.
● Het handhaven van DNA -integriteit voor stroomafwaartse toepassingen
Gebruik steriel, nuclease - gratis buizen en oplossingen om DNA -integriteit te behouden. Dit zorgt ervoor dat het DNA niet -besmet blijft en geschikt is voor toepassingen zoals klonen, sequencing en PCR.
OverBlueKit
Jiangsu Hillgene richtte zijn hoofdkantoor (10.000㎡ GMP -planten en R&D Center) op in Suzhou, gelegen in het Wuzhong -district, Suzhou, een Lakeshore City van het prachtige Taihu -meer, en twee productielocaties in Shenzhen en Shanghai, het productie van het productie van het productie van landelijke werkzaamheden. De site in North Carolina in de VS is momenteel in aanbouw, waardoor de wereldwijde aanwezigheid verder wordt verspreid. Hillgene heeft een uitdrukkelijke route opgebouwd voor het ontwikkelen van cellulaire therapieproducten, van ontdekking tot levering, met platforms voor productie van nucleïnezuur, serum - vrije suspensie, gesloten procesontwikkeling en QC -testen. BlueKit -producten zijn ontworpen voor kwaliteitscontrole, waardoor het succes van cellulaire therapie -innovaties zorgt.
Posttijd: 2024 - 09 - 05 14:47:03
