L-iżolament tad-DNA minn E. coli huwa proċedura fundamentali fil-bijoloġija molekulari. Dan l-artikolu se jimxi miegħek matul il-proċess kollu, u jipprovdi passi u spjegazzjonijiet dettaljati, u jiżgura li tifhem kemm ix-xjenza kif ukoll l-aspetti prattiċi tal-proċedura. Sew jekk int riċerkatur imħawwar jew ġdid fil-laboratorju, din il-gwida se tkun riżorsa siewja.
Preparazzjoni tas-sospensjoni taċ-ċellula
● Ġbir taċ-ċelloli E. coli
L-ewwel pass fl-iżolament tad-DNA minn E. coli jinvolvi l-ġbir taċ-ċelloli tal-batterja. Dan ġeneralment jirrikjedi li jikber E. coli f'mezz likwidu adattat sakemm jasal fil-fażi ta 'tkabbir logaritmiku. Iż-żmien huwa kruċjali minħabba li ċ-ċelloli f'din il-fażi huma l-iktar vijabbli u aktar faċli għal Lyse, li tirriżulta f'rendiment ogħla tad-DNA.
● Ċelloli li jerġgħu jsaħħu f'baffer xieraq
Iċ-ċelloli miġbura mbagħad jiġu sospiżi mill-ġdid f'buffer xieraq. Għażla komuni hija buffer Tris - EDTA (TE), li jgħin biex tinżamm l-integrità tad-DNA waqt il-proċess ta 'estrazzjoni. Il-buffer iservi għal skopijiet multipli: jistabbilizza l-pH, iqabbad katjoni divalenti li altrimenti jistgħu jiddegradaw id-DNA, u jipprovdi ambjent joniku ottimali għal reazzjonijiet enżimatiċi sussegwenti.
Ċentrifugazzjoni għaċ-ċelloli tal-pellet
● Parametri għal ċentrifugazzjoni (veloċità u ħin)
Wara l-bidu mill-ġdid taċ-ċelloli, is-sospensjoni hija soġġetta għal ċentrifugazzjoni għal pellet iċ-ċelloli. Il-veloċità u l-ħin taċ-ċentrifugazzjoni huma parametri kritiċi. Tipikament, ċentrifugazzjoni ssir għal madwar 4,000 - 6,000 g għal 10 - 15-il minuta f'4 ° C. Dan jiżgura li ċ-ċelloli jiffurmaw pellet issikkat fil-qiegħ tat-tubu taċ-ċentrifuga.
● Importanza ta 'pelleting xieraq
Pelleting xieraq huwa essenzjali biex jisseparaw iċ-ċelloli mill-mezz ta 'tkabbir u komponenti oħra li jinħallu. Pellet iffurmat tal-bir jagħmel il-passi sussegwenti aktar faċli u aktar effiċjenti, u jiżgura telf minimu ta 'ċelloli u, għalhekk, ir-rendiment massimu tad-DNA.
Tneħħija tas-supernatant
● Tekniki għat-tneħħija tas-supernatant
Ladarba ċ-ċelloli jiġu mqaxxra, is-supernatant (il-likwidu 'l fuq mill-pellet) għandu jitneħħa bir-reqqa mingħajr ma jiddisturba l-pellet taċ-ċellula. Dan ġeneralment isir bl-użu ta 'micropipette. Huwa kruċjali li twettaq dan il-pass metikolożament biex tevita li titlef xi ċelloli.
● L-iżgurar ta 'telf minimu ta' pellet taċ-ċelloli
L-iżgurar ta 'telf minimu tal-pellet taċ-ċellula jinvolvi pajpijiet bir-reqqa u, jekk meħtieġ, rawnds multipli ta' ċentrifugazzjoni u tneħħija tas-supernatant. L-għan huwa li żżomm kemm jista 'jkun ċelloli fil-pellet għall-irkupru massimu tad-DNA.
Żieda ta 'soluzzjoni ta' lisi tan-nuklei
● Komponenti tas-soluzzjoni tal-lisi tan-nuklei
Is-soluzzjoni tal-lisi tan-nuklei tipikament fiha deterġent (bħal SDS), buffer (bħal Tris - HCl), u aġent tal-kelanti (bħal EDTA). Id-deterġent ifixkel il-membrana taċ-ċellula u l-pakkett nukleari, u jirrilaxxa l-kontenut ċellulari, inkluż id-DNA, fis-soluzzjoni.
● Rwol fit-tkissir tal-ħitan taċ-ċelluli
Is-soluzzjoni tal-lisi tan-nuklei mhux biss il-membrana taċ-ċellula iżda wkoll tiċħad il-proteini u l-lipidi, li tkisser b'mod effettiv il-ħitan taċ-ċellula u l-pakketti nukleari biex tirrilaxxa d-DNA fis-soluzzjoni.
Respensjoni taċ-ċelloli
● Pajpijiet ġentili biex tevita shearing tad-DNA
Ladarba s-soluzzjoni tal-lisi tan-nuklei tiġi miżjuda, iċ-ċelloli jeħtieġ li jerġgħu jiġu sospiżi bil-mod biex jiġu evitati shearing tad-DNA. Il-shearing jista 'jkisser id-DNA fi frammenti iżgħar, li jistgħu jkunu problematiċi għal applikazzjonijiet downstream li jeħtieġu għoli - molekulari - Piż tad-DNA.
● L-iżgurar ta 'qawmien mill-ġdid sħiħ
Tkomplija kompluta tiżgura li ċ-ċelloli kollha jkunu lised b'mod uniformi, u jimmassimizzaw l-irkupru tad-DNA. Dan jista 'jinkiseb permezz ta' pipetting ġentili jew li jivvantaġġja s-soluzzjoni b'veloċità baxxa.
Inkubazzjoni għaċ-ċelloli tal-lyse
● L-issettjar tat-temperatura għall-inkubazzjoni
Iċ-ċelloli mill-ġdid huma inkubati f'temperatura speċifika biex tiġi żgurata lisi sħiħa. Dan ġeneralment isir minn 37 ° C sa 55 ° C. It-temperatura u t-tul eżatti jistgħu jvarjaw skont il-protokoll u r-rekwiżiti speċifiċi tal-kit ta 'iżolament tad-DNA li qed jintuża.
● Tul meħtieġa għal lisi effettiva
It-tul tipiku għall-inkubazzjoni huwa bejn 20 sa 30 minuta, iżda jista 'jiġi aġġustat abbażi tal-effiċjenza tal-lisi taċ-ċellula osservata. Inkubazzjoni fit-tul tista 'tkun meħtieġa għal-lisi sħiħa iżda għandha tkun ibbilanċjata kontra r-riskju ta' degradazzjoni tad-DNA.
Tkessiħ għat-temperatura tal-kamra
● Importanza ta 'tkessiħ gradwali
Wara l-inkubazzjoni, il-lisat jitkessaħ gradwalment għat-temperatura tal-kamra. It-tkessiħ gradwali jgħin fl-istabbilizzazzjoni tad-DNA u jimminimizza r-riskju ta 'xokk termali, li potenzjalment jista' jiddegrada d-DNA.
● Effetti fuq id-DNA u l-fdalijiet ċellulari
It-tkessiħ għat-temperatura tal-kamra jippermetti li l-fdalijiet ċellulari jippreċipitaw, u jagħmilha aktar faċli li tissepara d-DNA fil-passi sussegwenti. Dan jgħin ukoll biex jistabbilizza l-attivitajiet ta 'l-enzimi u jiffaċilita t-tneħħija ta' l-RNA permezz ta 'trattament RNase.
Żieda ta 'soluzzjoni RNase
● Għan ta 'RNase fil-proċedura
Is-soluzzjoni RNase hija miżjuda biex tiddegrada l-RNA, li altrimenti tista 'tippurifika mad-DNA u tinterferixxi ma' applikazzjonijiet downstream. L-RNase tiddiġerixxi b'mod selettiv l-RNA, u tħalli d-DNA intatt.
● Il-prevenzjoni tal-kontaminazzjoni tal-RNA
Il-prevenzjoni tal-kontaminazzjoni tal-RNA hija kruċjali għal applikazzjonijiet li jeħtieġu DNA pur, bħal PCR u sekwenzar. It-trattament RNase jiżgura li d-DNA iżolat huwa ħieles minn kontaminanti tal-RNA.
Purifikazzjoni tad-DNA
● Metodi għas-separazzjoni tad-DNA minn komponenti ċellulari oħra
Diversi metodi jistgħu jintużaw biex jippurifika d-DNA mil-lisat. Dawn jinkludu l-estrazzjoni tal-fenol - kloroform, preċipitazzjoni tal-etanol, u l-użu ta 'kits tad-DNA kummerċjali E. coli. Kull metodu għandu l-vantaġġi u l-iżvantaġġi tiegħu, bil-kits kummerċjali joffru konvenjenza u riżultati konsistenti.
● Konsiderazzjonijiet għall-purità tad-DNA
Il-purità hija fattur kritiku għas-suċċess ta 'applikazzjonijiet downstream. Kits kummerċjali, bħall-kit tad-DNA tat-terapija taċ-ċellula E. coli, huma ddisinjati biex jagħtu d-DNA ta 'purità għolja billi jneħħu b'mod effettiv il-proteini, il-lipidi, u kontaminanti oħra.
Ħażna u immaniġġjar ta 'DNA iżolat
● L-aħjar prattiki għall-ħażna tad-DNA
Ladarba ppurifikat, id-DNA għandu jinħażen f 'buffer adattat, bħal buffer TE, f' - 20 ° C jew - 80 ° C għal żmien twil - ħażna fit-tul. Evita l-iffriżar frekwenti - Ċikli jinħall peress li jistgħu jikkawżaw degradazzjoni tad-DNA.
● Iż-żamma tal-integrità tad-DNA għal applikazzjonijiet downstream
Biex iżżomm l-integrità tad-DNA, uża sterili, nuclease - tubi u soluzzjonijiet ħielsa. Dan jiżgura li d-DNA jibqa 'mhux kontaminat u adattat għal applikazzjonijiet bħal klonazzjoni, sekwenzar, u PCR.
MadwarBluekit
Jiangsu Hillgene stabbilixxa l-kwartieri ġenerali tiegħu (10,000 ㎡ Pjanti GMP u Ċentru R&D) f'Suzhou, li jinsab fid-distrett ta 'Wuzhong, Suzhou, belt lakeshore tal-Lag Taihu sabiħ, u żewġ siti tal-manifattura f'Shenzhen u Shanghai, li jestendu n-netwerk tal-manifattura tagħha nazzjonali. Is-sit ta 'North Carolina fl-Istati Uniti bħalissa jinsab taħt kostruzzjoni, u jkompli jxerred il-preżenza globali tiegħu. Hillgene bena mogħdija espressa għall-iżvilupp ta 'prodotti ta' terapija ċellulari, minn skoperta għall-kunsinna, bi pjattaformi għall-manifattura ta 'aċidu nuklejiku, serum - sospensjoni ħielsa li kultivazzjoni, żvilupp ta' proċess magħluq, u ttestjar QC. Il-prodotti BlueKit huma ddisinjati għall-kontroll tal-kwalità, li jiżguraw is-suċċess ta 'innovazzjonijiet ta' terapija ċellulari.
Post Ħin: 2024 - 09 - 05 14:47:03
