Mengasingkan DNA dari E. coli adalah prosedur asas dalam biologi molekul. Artikel ini akan membimbing anda melalui keseluruhan proses, memberikan langkah dan penjelasan terperinci, memastikan anda memahami kedua -dua sains dan aspek praktikal prosedur. Sama ada anda seorang penyelidik yang berpengalaman atau pendatang baru ke makmal, panduan ini akan menjadi sumber yang berharga.
Penyediaan penggantungan sel
● Pengumpulan sel E. coli
Langkah pertama dalam mengasingkan DNA dari E. coli melibatkan mengumpul sel -sel bakteria. Ini biasanya memerlukan peningkatan E. coli dalam medium cecair yang sesuai sehingga mencapai fasa pertumbuhan logaritma. Masa adalah penting kerana sel -sel dalam fasa ini paling berdaya maju dan lebih mudah untuk lyse, yang akan menghasilkan hasil DNA yang lebih tinggi.
● Sel -sel resuspending dalam penampan yang sesuai
Sel -sel yang dikumpulkan kemudiannya diselamatkan semula dalam penampan yang sesuai. Pilihan yang sama adalah penampan Tris - EDTA (TE), yang membantu mengekalkan integriti DNA semasa proses pengekstrakan. Penampan ini berfungsi dengan pelbagai tujuan: ia menstabilkan pH, chelates divalen kation yang boleh merendahkan DNA, dan menyediakan persekitaran ionik yang optimum untuk reaksi enzimatik berikutnya.
Sentrifugasi ke sel pelet
● Parameter untuk sentrifugasi (kelajuan dan masa)
Selepas memulihkan sel -sel, penggantungan itu tertakluk kepada sentrifugasi kepada pelet sel. Kelajuan dan masa sentrifugasi adalah parameter kritikal. Biasanya, sentrifugasi dilakukan pada sekitar 4,000 - 6,000 g selama 10 - 15 minit pada 4 ° C. Ini memastikan bahawa sel -sel membentuk pelet yang ketat di bahagian bawah tiub centrifuge.
● Kepentingan pelleting yang betul
Pelleting yang betul adalah penting untuk memisahkan sel -sel dari medium pertumbuhan dan komponen larut lain. Pelet yang dibentuk dengan baik membuat langkah -langkah seterusnya lebih mudah dan lebih cekap, memastikan kehilangan sel yang minimum dan, oleh itu, hasil DNA maksimum.
Pembuangan supernatan
● Teknik untuk penyingkiran supernatan
Sebaik sahaja sel -sel itu diletakkan, supernatan (cecair di atas pelet) mesti dikeluarkan dengan teliti tanpa mengganggu pelet sel. Ini biasanya dilakukan menggunakan mikropipet. Adalah penting untuk melaksanakan langkah ini dengan teliti untuk mengelakkan kehilangan mana -mana sel.
● Memastikan kehilangan pelet sel yang minimum
Memastikan kehilangan minimum pelet sel melibatkan pipet yang berhati -hati dan, jika perlu, pelbagai pusingan sentrifugasi dan penyingkiran supernatan. Matlamatnya adalah untuk mengekalkan sebanyak mungkin sel dalam pelet untuk pemulihan DNA maksimum.
Penambahan larutan lisis nukleus
● Komponen larutan lisis nukleus
Penyelesaian lisis nukleus biasanya mengandungi detergen (seperti SDS), penampan (seperti Tris - HCl), dan ejen chelating (seperti EDTA). Detergen mengganggu membran sel dan sampul nuklear, melepaskan kandungan selular, termasuk DNA, ke dalam larutan.
● Peranan dalam memecahkan dinding sel
Penyelesaian lysis nukleus bukan sahaja membran sel tetapi juga menafikan protein dan lipid, dengan berkesan memecahkan dinding sel dan sampul nuklear untuk melepaskan DNA ke dalam larutan.
Resuspensi sel
● Pipet lembut untuk mengelakkan ricih DNA
Sebaik sahaja larutan lisis nukleus ditambah, sel -sel perlu diselamatkan perlahan -lahan untuk mengelakkan ricih DNA. Shearing boleh memecahkan DNA ke dalam serpihan yang lebih kecil, yang boleh menjadi masalah untuk aplikasi hiliran yang memerlukan tinggi - molekul - DNA berat.
● Memastikan Resuspensi Lengkap
Resuspensi lengkap memastikan bahawa semua sel dilepaskan secara seragam, memaksimumkan pemulihan DNA. Ini boleh dicapai dengan pipet lembut atau vorteks penyelesaian pada kelajuan yang rendah.
Inkubasi ke sel lyse
● Tetapan suhu untuk pengeraman
Sel -sel yang diselamatkan diinkubasi pada suhu tertentu untuk memastikan lisis lengkap. Ini biasanya dilakukan pada suhu 37 ° C hingga 55 ° C. Suhu dan tempoh yang tepat boleh berbeza -beza bergantung kepada protokol dan keperluan khusus kit pengasingan DNA yang digunakan.
● Tempoh yang diperlukan untuk lisis yang berkesan
Tempoh tipikal untuk inkubasi adalah antara 20 hingga 30 minit, tetapi ia boleh diselaraskan berdasarkan kecekapan lisis sel yang diperhatikan. Pengeraman yang berpanjangan mungkin diperlukan untuk lisis lengkap tetapi harus seimbang terhadap risiko kemerosotan DNA.
Penyejukan ke suhu bilik
● Kepentingan penyejukan beransur -ansur
Selepas pengeraman, lysate secara beransur -ansur disejukkan ke suhu bilik. Penyejukan secara beransur -ansur membantu menstabilkan DNA dan meminimumkan risiko kejutan haba, yang berpotensi merendahkan DNA.
● Kesan pada DNA dan serpihan selular
Penyejukan ke suhu bilik membolehkan serpihan selular mendakan, menjadikannya lebih mudah untuk memisahkan DNA dalam langkah -langkah berikutnya. Ini juga membantu menstabilkan aktiviti enzim dan memudahkan penyingkiran RNA oleh rawatan RNase.
Penambahan penyelesaian RNase
● Tujuan RNase dalam prosedur
Penyelesaian RNase ditambah untuk menurunkan RNA, yang sebaliknya boleh disucikan dengan DNA dan mengganggu aplikasi hiliran. RNase secara selektif mencerna RNA, meninggalkan DNA utuh.
● Mencegah pencemaran RNA
Mencegah pencemaran RNA adalah penting untuk aplikasi yang memerlukan DNA tulen, seperti PCR dan penjujukan. Rawatan RNase memastikan bahawa DNA terpencil bebas daripada bahan pencemar RNA.
Pembersihan DNA
● Kaedah untuk memisahkan DNA dari komponen selular lain
Beberapa kaedah boleh digunakan untuk membersihkan DNA dari lysate. Ini termasuk pengekstrakan fenol - kloroform, pemendakan etanol, dan menggunakan kit DNA E. coli komersial. Setiap kaedah mempunyai kebaikan dan keburukannya, dengan kit komersial yang menawarkan kemudahan dan hasil yang konsisten.
● Pertimbangan untuk kesucian DNA
Kesucian adalah faktor kritikal untuk kejayaan aplikasi hiliran. Kit komersial, seperti terapi sel E. coli DNA kit, direka untuk menghasilkan DNA kemurnian yang tinggi dengan berkesan mengeluarkan protein, lipid, dan bahan cemar lain.
Penyimpanan dan pengendalian DNA terpencil
● Amalan terbaik untuk menyimpan DNA
Setelah disucikan, DNA harus disimpan dalam penampan yang sesuai, seperti penampan TE, pada - 20 ° C atau - 80 ° C untuk penyimpanan jangka panjang. Elakkan pembekuan yang kerap - kitaran cair kerana mereka boleh menyebabkan kemerosotan DNA.
● Mengekalkan integriti DNA untuk aplikasi hiliran
Untuk mengekalkan integriti DNA, gunakan steril, nukleus - tiub dan penyelesaian percuma. Ini memastikan bahawa DNA tetap tidak tercemar dan sesuai untuk aplikasi seperti pengklonan, penjujukan, dan PCR.
MengenaiBluekit
Jiangsu Hillgene menubuhkan ibu pejabatnya (10,000 tumbuhan GMP dan pusat R & D) di Suzhou, yang terletak di daerah Wuzhong, Suzhou, sebuah kota lakeshore tasik Taihu yang indah, dan dua tapak pembuatan di Shenzhen dan Shanghai, memperluaskan rangkaian pembuatannya di seluruh negara. Tapak North Carolina di Amerika Syarikat sedang dalam pembinaan, menyebarkan kehadiran globalnya. Hillgene telah membina laluan ekspres untuk membangunkan produk terapi selular, dari penemuan ke penghantaran, dengan platform untuk pembuatan asid nukleik, serum - penggantungan bebas, pembangunan proses tertutup, dan ujian QC. Produk Bluekit direka untuk kawalan kualiti, memastikan kejayaan inovasi terapi selular.
Masa Pos: 2024 - 09 - 05 14:47:03
