Изолирање на ДНК од E. coli е фундаментална постапка во молекуларната биологија. Оваа статија ќе ве прошета низ целиот процес, давајќи детални чекори и објаснувања, осигурувајќи дека ги разбирате и науката и практичните аспекти на постапката. Без разлика дали сте сезонски истражувач или новодојденец во лабораторијата, овој водич ќе биде вреден ресурс.
Подготовка на суспензија на клетките
● Собирање на клетки на E. coli
Првиот чекор во изолирањето на ДНК од E. coli вклучува собирање на бактериски клетки. Ова обично бара одгледување E. coli во соодветен течен медиум сè додека не ја достигне логаритамската фаза на раст. Времето е клучно затоа што клетките во оваа фаза се најостварливи и полесни за лизи, што ќе резултира во поголем принос на ДНК.
● Преобликување на клетките во соодветен тампон
Собраните клетки потоа се суспендираат во соодветен тампон. Заеднички избор е тампон Трис - ЕДТА (ТЕ), кој помага во одржувањето на интегритетот на ДНК за време на процесот на екстракција. Тампон служи повеќе цели: ја стабилизира pH вредноста, хелати дивалентни катјони кои инаку би можеле да ја деградираат ДНК и обезбедува оптимална јонска околина за последователни ензимски реакции.
Центрифугирање на клетките на пелетите
● Параметри за центрифугирање (брзина и време)
По повторното суспендирање на клетките, суспензијата е подложена на центрифугирање за да ги пеле клетките. Брзината и времето на центрифугирање се клучни параметри. Обично, центрифугирањето се изведува на околу 4.000 - 6.000 g за 10 - 15 минути на 4 ° C. Ова осигурува дека клетките формираат тесна пелета на дното на цевката за центрифуга.
● Важноста на правилното пелетирање
Правилното пелетирање е неопходно за да се одделат клетките од медиумот за раст и другите растворливи компоненти. Добро - формирана пелета ги прави последователните чекори полесни и поефикасни, обезбедувајќи минимално губење на клетките и, според тоа, максимален принос на ДНК.
Отстранување на супернатан
● Техники за супернатантно отстранување
Откако ќелиите ќе бидат пелети, супернатантот (течноста над пелетот) мора внимателно да се отстрани без да се наруши мобилниот пелет. Ова обично се прави со употреба на микропипета. Клучно е да се изврши овој чекор прецизно за да се избегне губење на клетки.
● Обезбедување минимално губење на мобилните пелети
Обезбедување минимално губење на клеточната пелета вклучува внимателно пипетирање и, доколку е потребно, повеќе рунди на центрифугирање и супернатантно отстранување. Целта е да се задржат што е можно повеќе клетки во пелетот за максимално закрепнување на ДНК.
Додавање на раствор за лиза на јадра
● Компоненти на растворот за лиза на јадрата
Растворот за лиза на јадрата обично содржи детергент (како SDS), тампон (како што е Tris - HCl) и агент за хелатирање (како ЕДТА). Детергентот ја нарушува клеточната мембрана и нуклеарниот плик, ослободувајќи ја содржината на клетката, вклучително и ДНК, во растворот.
● Улога во распаѓање на wallsидовите на клетките
Растворот за лиза на јадрата не само што ја лиса клеточната мембрана, туку исто така ги денатурира протеините и липидите, ефикасно ги сруши wallsидовите на клетките и нуклеарните коверти за ослободување на ДНК во растворот.
Повторно суспензија на клетките
● Нежно пипетинг за да се избегне стрижење на ДНК
Откако ќе се додаде растворот за лиза на јадрата, клетките треба да бидат повторно суспендирани нежно за да се избегне стрижење на ДНК. Смеењето може да ја сруши ДНК во помали фрагменти, што може да биде проблематично за апликациите низводно за кои е потребна висока - молекуларна - тежина ДНК.
● Обезбедување на целосна суспензија
Комплетното суспензија гарантира дека сите клетки се лизираат рамномерно, максимизирајќи го закрепнувањето на ДНК. Ова може да се постигне со нежно пипетирање или вртење на растворот со мала брзина.
Инкубација на клетките на лизи
● Температурни поставки за инкубација
Поставените клетки се инкубираат на одредена температура за да се обезбеди целосна лиза. Ова обично се прави на 37 ° C до 55 ° C. Точната температура и времетраењето можат да варираат во зависност од протоколот и специфичните барања на комплетот за изолација на ДНК што се користат.
● Потребно е времетраење за ефективна лиза
Типичното времетраење за инкубација е помеѓу 20 до 30 минути, но може да се прилагоди врз основа на ефикасноста на набудуваната клеточна лиза. Продолжената инкубација може да биде неопходна за целосна лиза, но треба да биде избалансирана во однос на ризикот од деградација на ДНК.
Ладење на собна температура
● Важноста на постепеното ладење
По инкубацијата, лисатот постепено се лади на собна температура. Постепеното ладење помага во стабилизирање на ДНК и го минимизира ризикот од термички шок, што може потенцијално да ја деградира ДНК.
● Ефекти врз ДНК и клеточните остатоци
Ладењето на собна температура им овозможува на клеточните остатоци да се таложат, со што е полесно да се оддели ДНК во последователните чекори. Ова исто така помага да се стабилизираат ензимските активности и да се олесни отстранувањето на РНК со третман на РНС.
Додавање на раствор RNase
● Цел на РНС во постапката
Решението RNase се додава за да се деградира РНК, што инаку може да се прочисти со ДНК и да се меша во низводните апликации. RNase селективно ја вари РНК, оставајќи ја ДНК недопрена.
● Спречување на загадување на РНК
Спречувањето на контаминација на РНК е клучно за апликациите за кои е потребна чиста ДНК, како што се PCR и секвенционирање. Третманот со RNase гарантира дека изолираната ДНК е ослободена од загадувачи на РНК.
Прочистување на ДНК
● Методи за одвојување на ДНК од други мобилни компоненти
Неколку методи можат да се користат за прочистување на ДНК од лисатот. Овие вклучуваат екстракција на фенол - хлороформ, врнежи од етанол и употреба на комерцијални комплети за ДНК на E. coli. Секој метод има свои добрите и лошите страни, при што комерцијалните комплети нудат погодност и постојани резултати.
● Размислувања за чистота на ДНК
Чистотата е клучен фактор за успех на низводните апликации. Комерцијалните комплети, како што е клеточната терапија E. coli DNA комплет, се дизајнирани да дадат висока - чистота ДНК со ефикасно отстранување на протеините, липидите и другите загадувачи.
Складирање и ракување со изолирана ДНК
● Најдобри практики за складирање на ДНК
Откако ќе се прочисти, ДНК треба да се чува во соодветен тампон, како тампон, на - 20 ° C или - 80 ° C за долго - складирање на терминот. Избегнувајте чести замрзнати - циклуси на затоплување бидејќи можат да предизвикаат деградација на ДНК.
● Одржување на интегритетот на ДНК за апликации од низводно
За одржување на интегритетот на ДНК, користете стерилни, нуклеази - бесплатни цевки и решенија. Ова осигурува дека ДНК останува неконтаминирана и погодна за апликации како што се клонирање, секвенционирање и ПЦР.
ЗаБлукит
Iangиангсу Хилгене го основаше своето седиште (10,000 ㎡ ГМП растенија и Центар за истражување и развој) во Суджу, лоциран во округот Вужонг, Суджоу, град на езерото на прекрасното езеро Таих и две производствени места во Шенжен и Шангај, проширувајќи ја својата производствена мрежа на национално ниво. Веб -страницата на Северна Каролина во САД во моментов е во фаза на изградба, што дополнително го шири своето глобално присуство. Хилген има изградено експресна патека за развој на производи за мобилна терапија, од откривање до испорака, со платформи за производство на нуклеинска киселина, серум - бесплатно култивирање на суспензија, развој на затворен процес и тестирање на КК. Производите на BlueKit се дизајнирани за контрола на квалитетот, обезбедувајќи успех на иновациите на клеточна терапија.
Време на објавување: 2024 - 09 - 05 14:47:03
