Izolējoša DNS no E. coli ir pamatprocedūra molekulārajā bioloģijā. Šajā rakstā tiks apskatīts viss process, nodrošinot detalizētus pasākumus un skaidrojumus, nodrošinot, ka jūs saprotat gan zinātni, gan procedūras praktiskos aspektus. Neatkarīgi no tā, vai esat pieredzējis pētnieks vai laboratorijas jaunpienācējs, šī rokasgrāmata būs vērtīgs resurss.
Šūnu suspensijas sagatavošana
● E. coli šūnu kolekcija
Pirmais DNS izolēšanas solis no E. coli ietver baktēriju šūnu savākšanu. Parasti tas prasa audzēt E. coli piemērotā šķidruma vidē, līdz tā sasniedz logaritmisko augšanas fāzi. Laiks ir ļoti svarīgs, jo šūnas šajā fāzē ir visspēcīgākās un vieglāk izveicamās, kā rezultātā būs lielāka DNS raža.
● atkārtotas suspendēšanas šūnas atbilstošā buferšķīdumā
Pēc tam savāktās šūnas tiek atkārtoti suspendētas piemērotā buferšķīdumā. Kopīga izvēle ir Tris - EDTA (TE) buferis, kas palīdz saglabāt DNS integritāti ekstrakcijas procesā. Buferis kalpo vairākiem mērķiem: tas stabilizē pH, helātu divvērtīgus katjonus, kas citādi varētu noārdīt DNS, un nodrošina optimālu jonu vidi turpmākām fermentatīvām reakcijām.
Centrifugēšana granulu šūnās
● Centrifugēšanas parametri (ātrums un laiks)
Pēc šūnu atkārtotas suspozācijas suspensija tiek pakļauta centrifugēšanai šūnu granulos. Centrifugēšanas ātrums un laiks ir kritiski parametri. Parasti centrifugēšanu veic aptuveni 4000 - 6000 g 10 - 15 minūtes 4 ° C temperatūrā. Tas nodrošina, ka šūnas centrifūgas caurules apakšā veido stingri granulu.
● Pareizas granulēšanas nozīme
Pareiza granulēšana ir būtiska, lai šūnas atdalītu no augšanas barotnes un citām šķīstošām komponentiem. Augu - veidota granula padara nākamos posmus vieglākus un efektīvākus, nodrošinot minimālu šūnu zaudēšanu un līdz ar to arī maksimālo DNS ražu.
Supernatanta noņemšana
● Supernatanta noņemšanas paņēmieni
Kad šūnas ir granulētas, supernatants (šķidrums virs granulas) rūpīgi jānoņem, netraucējot šūnu granulu. Parasti to dara, izmantojot mikropipeti. Ir svarīgi rūpīgi veikt šo soli, lai nezaudētu jebkuru šūnu.
● Minimāla šūnu granulu zaudēšanas nodrošināšana
Nodrošināt minimālu šūnu granulu zaudēšanu ir saistīta ar rūpīgu pipetēšanu un, ja nepieciešams, vairākas centrifugēšanas un supernatanta noņemšanas kārtas. Mērķis ir saglabāt pēc iespējas vairāk šūnu granulā maksimālai DNS atjaunošanai.
Kodolu līzes šķīduma pievienošana
● Kodolu līzes šķīduma komponenti
Kodolu līzes šķīdumā parasti ir mazgāšanas līdzeklis (piemēram, SDS), buferis (piemēram, Tris - HCl) un helātu veidošanas līdzeklis (piemēram, EDTA). Mazgāšanas līdzeklis izjauc šūnu membrānu un kodola aploksni, izdalot šūnu saturu, ieskaitot DNS, šķīdumā.
● Loma šūnu sienu sadalīšanā
Kodolu līzes šķīdums ne tikai lizē šūnu membrānu, bet arī denaturē olbaltumvielas un lipīdus, efektīvi sadalot šūnu sienas un kodola aploksnes, lai DNS izdalītu šķīdumā.
Šūnu atkārtota suspensija
● Maiga pipetēšana, lai izvairītos no DNS cirpšanas
Kad ir pievienots kodolu līzes šķīdums, šūnas ir maigi jāuztur, lai izvairītos no DNS cirpšanas. Bīdīšana var sadalīt DNS mazākos fragmentos, kas var būt problemātiski pakārtotām lietojumiem, kuriem nepieciešama augsta - Molekulārā - svara DNS.
● Pilnīgas atkārtotas suspensijas nodrošināšana
Pilnīga atkārtota suspensija nodrošina, ka visas šūnas tiek lizētas vienmērīgi, maksimizējot DNS atjaunošanos. To var panākt, maigi pipetējot vai vorteksējot šķīdumu ar nelielu ātrumu.
Inkubācija Lyse šūnās
● Inkubācijas temperatūras iestatījumi
Lai nodrošinātu pilnīgu līzi, inkubētas atkārtotas suspendētās šūnas. Parasti to veic no 37 ° C līdz 55 ° C. Precīza temperatūra un ilgums var mainīties atkarībā no protokola un izmantotā DNS izolācijas komplekta īpašajām prasībām.
● Ilgums, kas nepieciešams efektīvai līzei
Parasti inkubācijas ilgums ir no 20 līdz 30 minūtēm, bet to var pielāgot, pamatojoties uz novēroto šūnu līzes efektivitāti. Ilgstoša inkubācija var būt nepieciešama pilnīgai līzei, bet tā jāsabalansē ar DNS sadalīšanās risku.
Dzesēšana līdz istabas temperatūrai
● Pakāpeniskas dzesēšanas nozīme
Pēc inkubācijas lizāts tiek pakāpeniski atdzesēts līdz istabas temperatūrai. Pakāpeniska dzesēšana palīdz stabilizēt DNS un samazina termiskā šoka risku, kas varētu potenciāli noārdīt DNS.
● Ietekme uz DNS un šūnu atlūzām
Dzesēšana līdz istabas temperatūrai ļauj šūnu gružiem nogulsnēties, padarot DNS vieglāku atdalīšanu turpmākajās darbībās. Tas arī palīdz stabilizēt enzīmu aktivitātes un atvieglo RNS noņemšanu, apstrādājot RNase.
RNāzes šķīduma pievienošana
● RNāzes mērķis procedūrā
RNāzes šķīdums tiek pievienots RNS sadalīšanai, kas citādi varētu co - attīrīt ar DNS un traucēt pakārtotajām lietojumprogrammām. RNāze selektīvi sagremo RNS, atstājot DNS neskartu.
● RNS piesārņojuma novēršana
RNS piesārņojuma novēršanai ir izšķiroša nozīme lietojumprogrammām, kurām nepieciešama tīra DNS, piemēram, PCR un sekvencēšana. Ārstēšana ar RNāzes nodrošina, ka izolētā DNS nav bez RNS piesārņotājiem.
DNS attīrīšana
● DNS atdalīšanas metodes no citiem šūnu komponentiem
DNS attīrīšanai no lizāta var izmantot vairākas metodes. Tajos ietilpst fenols - hloroforma ekstrakcija, etanola nokrišņi un komerciālo E. coli DNS komplektu izmantošana. Katrai metodei ir savi plusi un mīnusi, un komerciālie komplekti piedāvā ērtības un konsekventus rezultātus.
● DNS tīrības apsvērumi
Tīrība ir kritisks faktors pakārtoto lietojumprogrammu panākumiem. Komerciālie komplekti, piemēram, šūnu terapija E. coli DNS komplekts, ir izstrādāti, lai iegūtu augstu - tīrības DNS, efektīvi noņemot olbaltumvielas, lipīdus un citus piesārņotājus.
Izolētas DNS glabāšana un apstrāde
● DNS glabāšanas paraugprakse
Pēc attīrīšanas DNS jāuzglabā piemērotā buferšķīdumā, piemēram, TE buferšķīdumā, - 20 ° C vai - 80 ° C garai - Termiņa uzglabāšanai. Izvairieties no biežas sasaldēšanas - Atkausēšanas cikli, jo tie var izraisīt DNS sadalīšanos.
● DNS integritātes saglabāšana pakārtotajām lietojumprogrammām
Lai saglabātu DNS integritāti, izmantojiet sterilu, nukleāzi - bezmaksas caurules un risinājumi. Tas nodrošina, ka DNS paliek nepiesārņota un piemērota tādām lietojumprogrammām kā klonēšana, secība un PCR.
PretBlukit
Jiangsu Hillgene nodibināja savu galveno mītni (10 000㎡ GMP rūpnīcas un R&D centru) Suzhou, kas atrodas Vuzhongas apgabalā, Suzhou, ezera krasta pilsētā skaistajā Taihu ezerā un divas ražošanas vietas Šenženā un Šanhajā, pagarinot tā ražošanas tīklu Nationwide. Ziemeļkarolīnas vieta ASV šobrīd tiek būvēta, turpinot izplatīt savu klātbūtni globālā stāvoklī. Hillgene ir izveidojis skaidru ceļu šūnu terapijas izstrādājumu izstrādei, sākot no atklāšanas līdz piegādei, ar platformām nukleīnskābju ražošanai, serumā - Bezmaksas suspensijas kultivēšana, slēgta procesa izstrāde un QC pārbaude. Bluekit produkti ir izstrādāti kvalitātes kontrolei, nodrošinot šūnu terapijas inovāciju panākumus.
Pasta laiks: 2024 - 09 - 05 14:47:03
