E. Coli-ден оқшауланған ДНҚ - бұл молекулалық биологиядағы негізгі процедура. Бұл мақала сізді бүкіл процестер арқылы жүреді, егжей-тегжейлі қадамдар мен түсіндірмелер беру, бұл сіздің ғылымның да, процедураның практикалық аспектілерін де түсінуге мүмкіндік беретін егжей-тегжейлі қадамдар мен түсіндірмелер береді. Сіз тәжірибелі зерттеуші болсаңыз да, зертханаға жаңадан келген болсаңыз да, бұл нұсқаулық құнды ресурс болады.
Жасушалық аспалы дайындау
● E. Coli жасушаларының коллекциясы
ДНҚ-ны оқшаулайтын ДНҚ-ның алғашқы қадамы бактериялық жасушаларды жинауды қамтиды. Бұл әдетте E. Coli өсіруді қажет етеді, ол сұйық ортада, ол логарифмдік өсу кезеңіне дейін. Уақыт өте маңызды, өйткені осы кезеңдегі жасушалар ең тиімді және LYSE-ді жеңілдетеді, бұл ДНҚ кірістілігінің жоғарылауына әкеледі.
● Тиісті буфердегі ұяшықтарды қалпына келтіру
Жиналған ұяшықтар тиісті буфермен қалпына келтіріледі. Жалпы таңдау - бұл Трис - EDTA (TE) буфері, бұл өндіру процесінде ДНҚ тұтастығын сақтауға көмектеседі. Буфер бірнеше мақсаттарға қызмет етеді: ол рН тұрақтайды, ол ДНҚ-ды нашарлатады, олар DNA-ды нашарлатады және одан басқа DNA-ді нашарлатады және одан кейінгі ферментативті реакциялар үшін оңтайлы иондық ортаға ие.
Тіркелетін жасушаларға центрифугалау
● центрифугалаудың параметрлері (жылдамдық пен уақыт)
Ұяшықтарды қайта өңдейтіннен кейін суспензия түйіршікке түйіршікке жасушалардан өтеді. Орталық жылдамдық пен уақыт маңызды параметрлер болып табылады. Әдетте, центрифугалау шамамен 4000-да жүзеге асырылады Бұл жасушалардың центрифуга түтігінің түбінде тығыз түйіршік түрін қалыптастыруды қамтамасыз етеді.
● Дұрыс түйіршіктердің маңызы
Дұрыс түйіршіктер жасушаларды өсу ортасынан және басқа еритін компоненттерден бөлу үшін қажет. Ұңғылар - Құрылған түйіршік кейіннен келесі әрекеттерді жеңілдетеді және тиімді етеді, сонымен қатар жасушалардың минималды жоғалуын қамтамасыз етеді, демек, ДНҚ-ның максималды өнімділігі.
Супернатрантты жою
● Тамаша алып тастау әдістері
Жасушалар түйіршіктелгеннен кейін, супернатант (түйіршіктің үстіндегі сұйықтық) ұяшық түйіршікті алаңдатпай абай болу керек. Бұл әдетте микропипет көмегімен жасалады. Бұл қадамды кез-келген жасушаны жоғалтпау үшін өте маңызды.
● Жасуша түйіршесінің минималды жоғалуын қамтамасыз ету
Жасуша түйіршесінің минималды жоғалуын қамтамасыз ету мұқият тамштарды, қажет болған жағдайда центрифугалау мен супернатранттардың бірнеше раундын қамтиды. Мақсат - ДНҚ-ны ең көп қалпына келтіру үшін түйіршіктің мүмкіндігінше көп ұяшықтарды сақтау.
Ядролық лизис ерітіндісін қосу
● Ядролық лизис ерітіндісінің компоненттері
Ядролық лизис ерітіндісінде әдетте жуғыш зат бар (SDS сияқты), буфер (мысалы, Трис - HCL), ал хеллативті агент (EDTA сияқты). Жуғыш зат жасуша мембранасы мен ядролық конвертті бұзады, жасушалық мазмұнды, соның ішінде ДНҚ-ны, шешімге дейін.
● Ұяшық қабырғаларын түсірудегі рөл
Ядролық лизис Шешімі тек жасуша мембранасын лизоза өткізіп қана қоймайды, сонымен қатар ақуыздар мен липидтерді денатуризациялайды, сонымен қатар DNA-ны ерітіндіге шығару үшін жасуша қабырғалары мен ядролық конверттерді тиімді түрде бұзады.
Ұяшықтардың реанимациясы
● ДНҚ-ны аулақ болу үшін жұмсақ тамырлар
Ядролық лизис ерітіндісі қосылғаннан кейін, ДНҚ-ның қыңырын болдырмас үшін ұяшықтарды ақырын қалпына келтіру керек. Қырыну ДНҚ-ны кішігірім фрагменттерге сындыруы мүмкін, бұл жоғары ағынды қолданбалар үшін қиын болуы мүмкін - молекулалық - Салмағы ДНҚ.
● толық реанимацияны қамтамасыз ету
Толық реанимация барлық ұяшықтардың біркелкі лизисі, ДНҚ қалпына келтіруін барынша, қамтамасыз етеді. Бұған жұмсақ тамшумен қол жеткізуге немесе шешімге төмен жылдамдықпен қол жеткізуге болады.
Lyse ұяшықтарына инкубация
● Инкубацияға арналған температура параметрлері
Толық лизисті қамтамасыз ету үшін қайта өңделген ұяшықтар белгілі бір температурада инкубацияланады. Бұл әдетте 37 ° C-тан 55 ° C температурада жасалады. Дәл температура мен ұзақтығы протоколға және ДНҚ оқшаулау жинағының нақты талаптарына байланысты өзгеруі мүмкін.
● Тиімді лизис үшін қажет уақыт
Инкубацияның әдеттегі ұзақтығы 20-30 минут аралығында, бірақ оны байқалған жасушаның лизисінің тиімділігіне қарай реттеуге болады. Ұзақ уақытқа созылған инкубация толық лизис үшін қажет болуы мүмкін, бірақ ДНҚ деградация қаупі бар болуы керек.
Бөлме температурасына дейін салқындату
● біртіндеп салқындатудың маңыздылығы
Инкубациядан кейін лизат біртіндеп бөлме температурасына дейін салқындатылады. Біртіндеп салқындату ДНҚ-ны тұрақтандыруға көмектеседі және ДНҚ-ны нашарлатуы мүмкін жылу шок қаупін азайтады.
● ДНҚ және ұялы қоқыстарға әсер етеді
Бөлме температурасына дейін салқындату жасуша қоқыстарына жауып тастауға мүмкіндік береді, бұл ДНҚ-ны келесі қадамдарда бөлуді жеңілдетеді. Бұл сонымен қатар ферменттердің белсенділігін тұрақтандыруға көмектеседі және РНҚ-ны RNNE-ді RNase емдеу арқылы жоюға көмектеседі.
RNase ерітіндісін қосу
● РНСА-ның мақсаты
RNA ерітіндісі RNA-ді Drine-ді, басқаша түрде ДНҚ-мен тазартып, төменгі ағыс қолданбаларына кедергі келтіруі мүмкін. RNA RNA-ны таңқалдырып, ДНҚ-дан қалдырады.
● РНҚ-ның ластануын болдырмау
РНҚ-ның ластануының алдын алу ПТР және реттілік сияқты таза ДНҚ-ны қажет ететін қосымшалар үшін өте маңызды. Rnase емі оқшауланған ДНҚ-ның РНҚ-ның ластаушы заттарынан босатылуын қамтамасыз етеді.
ДНҚ-ны тазарту
● ДНҚ-ны басқа жасушалық компоненттерден бөлу әдістері
ДНҚ-ны лизаттан тазарту үшін бірнеше әдісті қолдануға болады. Оларға фенол - хлороформ өндіру, этанол жауын-шашын және коммерциялық E. Coli DNA жиынтықтарын қолдану. Әрбір әдістің өз қолдық пен жағымсыз жақтары бар, коммерциялық жинақтармен ыңғайлы және дәйекті нәтижелер ұсынады.
● ДНҚ тазалығын ескеру
Тазалық - бұл төменгі ағымдағы қосымшалардың сәттілігінің маңызды факторы. Жасушалық терапия сияқты коммерциялық жиынтықтар E. Coli DNA WIN коды, ақуыздар, липидтер және басқа да ластанушыларды тиімді түрде алып тастау арқылы жоғары - Тазалық ДНҚ-сы атуға арналған.
Оқшауланған ДНҚ сақтау және өңдеу
ДНҚ-ны сақтаудың озық тәжірибелері
Тазартылғаннан кейін ДНҚ-ны Те буфері сияқты, ұзындығы 20 ° C немесе - Ұзақ уақытқа 80 ° C немесе - сақтау керек. Жиі мұздатудан аулақ болыңыз - ДНҚ деградациясын тудыруы мүмкін.
● Төмен ағыс қолданбалар үшін ДНҚ тұтастығын сақтау
ДНҚ тұтастығын сақтау үшін стерильді, нуклеазды қолданыңыз - Тегін түтіктер мен шешімдер. Бұл ДНҚ-ның реттелмеуін және клондау, реттілік және ПТР сияқты қосымшаларға сәйкес келетіндігін қамтамасыз етеді.
ЖөніндеКөкжайы
Цзянсу Хилгене өзенінің штаб-пәтерін (10 000㎡ GMP өсімдіктері және орталығы) Вужон ауданында, Сужон ауданында, Сужоу, Тайху көлінің лекшор қаласында, ал Шэньчу және Шанхайда орналасқан екі өндірістік учаскеде, бүкіл ел бойынша өндірістік желілерде орналасқан. Қазіргі уақытта АҚШ-тағы Солтүстік Каролина учаскесі оның жаһандық қатысуын одан әрі таратып жатыр. Хиллген субуалды терапия өнімдерін дамытуға, ашудан бастап, нуклеин қышқылын өндіруге арналған платформалармен, сарысумен, сарысуды, жабық процесті дамыту және QC тестілеуі үшін экспресс жасады. BlueKit өнімдері сапаны бақылауға, жасушалық терапияның инновацияларының сәттілігін қамтамасыз етеді.
POST уақыты: 2024 - 09 - 09 - 05 14:47:03
