დნმ -ის იზოლირება E. coli- სგან ფუნდამენტური პროცედურაა მოლეკულურ ბიოლოგიაში. ეს სტატია გაგიჩნდებათ მთელი პროცესით, დეტალური ნაბიჯებისა და ახსნა -განმარტებების გათვალისწინებით, რაც უზრუნველყოფს როგორც მეცნიერებას, ასევე პროცედურის პრაქტიკულ ასპექტებს. თუ თქვენ ხართ სეზონური მკვლევარი ან ლაბორატორიის ახალბედა, ეს სახელმძღვანელო იქნება ღირებული რესურსი.
უჯრედის შეჩერების მომზადება
E. E. coli უჯრედების შეგროვება
პირველი ნაბიჯი E. coli- სგან დნმ -ის იზოლირებისთვის მოიცავს ბაქტერიული უჯრედების შეგროვებას. ეს ჩვეულებრივ მოითხოვს E. coli– ს ზრდას შესაბამის თხევად საშუალებებში, სანამ ის მიაღწევს ლოგარითმული ზრდის ფაზას. დრო გადამწყვეტია, რადგან ამ ფაზაში უჯრედები ყველაზე სიცოცხლისუნარიანია და უფრო ადვილია LYSE, რაც გამოიწვევს დნმ -ის უფრო მაღალ მოსავალს.
● უჯრედების გადაკეთება შესაბამის ბუფერში
შეგროვებული უჯრედები შემდეგ შეჩერებულია შესაფერისი ბუფერში. საერთო არჩევანი არის Tris - EDTA (TE) ბუფერი, რომელიც ხელს უწყობს დნმ -ის მთლიანობის შენარჩუნებას მოპოვების პროცესში. ბუფერი ემსახურება მრავალ მიზანს: ის სტაბილიზირებს pH- ს, ჩელატებს დივალენტურ კატიონებს, რომელსაც სხვაგვარად შეუძლია დნმ -ის დეგრადაცია და უზრუნველყოფს ოპტიმალურ იონურ გარემოს შემდგომი ფერმენტული რეაქციებისათვის.
ცენტრიფუგირება გრანულების უჯრედებში
● პარამეტრები ცენტრიფუგირებისთვის (სიჩქარე და დრო)
უჯრედების აღდგენის შემდეგ, სუსპენზია ექვემდებარება ცენტრიფუგაციას უჯრედების დასაფენად. ცენტრიფუგირების სიჩქარე და დრო კრიტიკული პარამეტრებია. როგორც წესი, ცენტრიფუგა ხორციელდება დაახლოებით 4,000 - 6,000 გ -ზე 10 - 15 წუთი 4 ° C ტემპერატურაზე. ეს უზრუნველყოფს, რომ უჯრედები ქმნიან მჭიდრო გრანპს ცენტრიფუგის მილის ძირში.
● სათანადო გრანულების მნიშვნელობა
სათანადო გათიშვა აუცილებელია უჯრედების ზრდის საშუალო და სხვა ხსნადი კომპონენტებისგან განცალკევებისთვის. ჭაბურღილი - ჩამოყალიბებული გრამი ხდის შემდგომ ნაბიჯებს უფრო ადვილი და ეფექტური, რაც უზრუნველყოფს უჯრედების მინიმალურ დაკარგვას და, შესაბამისად, დნმ -ს მაქსიმალურ მოსავლიანობას.
ზებუნების მოცილება
● ტექნიკა ზებუნებრივი მოცილებისთვის
მას შემდეგ, რაც უჯრედები გახეხილია, ზებუნა (გროვის ზემოთ თხევადი) ფრთხილად უნდა მოიხსნას უჯრედის გრანულების დარღვევის გარეშე. ეს ჩვეულებრივ კეთდება მიკროპიპეტის გამოყენებით. გადამწყვეტი მნიშვნელობა აქვს ამ ნაბიჯის სრულყოფილად შესრულებას, რათა თავიდან აიცილოთ რაიმე უჯრედების დაკარგვა.
Cell უჯრედების გრანულების მინიმალური დაკარგვის უზრუნველყოფა
უჯრედის გრანულების მინიმალური დაკარგვის უზრუნველყოფა გულისხმობს ფრთხილად მილსადენებს და, საჭიროების შემთხვევაში, ცენტრიფუგირების მრავალჯერადი წრე და ზებუნებრივი მოცილება. მიზანია, რაც შეიძლება მეტი უჯრედის შენარჩუნება, დნმ -ის მაქსიმალური აღდგენისთვის.
ბირთვების ლიზის ხსნარის დამატება
● ბირთვების ლიზის ხსნარის კომპონენტები
ბირთვების ლიზის ხსნარი, როგორც წესი, შეიცავს სარეცხი საშუალებას (მაგალითად SDS), ბუფერული (მაგალითად, TRIS - HCl) და ჩელინგული აგენტი (როგორც EDTA). სარეცხი საშუალება არღვევს უჯრედის მემბრანასა და ბირთვულ კონვერტს, ხსნარში ათავისუფლებს უჯრედულ შინაარსს, მათ შორის დნმ -ს.
● როლი უჯრედის კედლების დაშლაში
ბირთვების ლიზის ხსნარი არამარტო უჯრედის მემბრანას აყენებს, არამედ ცილებსა და ლიპიდებსაც ახდენს დენატურირებს, რაც ეფექტურად იშლება უჯრედის კედლებსა და ბირთვულ კონვერტებს, რათა დნმ -ის ხსნარში გაათავისუფლონ.
უჯრედების აღორძინება
● ნაზი პიპეტინგი, რათა თავიდან ავიცილოთ დნმ -ის გაჭიმვა
ბირთვების ლიზის ხსნარის დამატების შემდეგ, უჯრედები ნაზად უნდა შეაჩერონ, რათა თავიდან აიცილონ დნმ -ის გაჭიმვა. გაჭედვამ შეიძლება დნმ -ს დაარღვიოს მცირე ფრაგმენტებად, რაც შეიძლება პრობლემური იყოს ქვემო დინების პროგრამებისთვის, რომლებიც საჭიროებენ მაღალ - მოლეკულურ - წონის დნმ.
● სრულად აღორძინების უზრუნველყოფა
სრული აღორძინება უზრუნველყოფს, რომ ყველა უჯრედი ერთნაირად ლიზირებული იყოს, რაც მაქსიმალურად გაზრდის დნმ -ს აღდგენას. ამის მიღწევა შესაძლებელია ნაზი პიპეტინგით ან ხსნარის დაბალი სიჩქარით.
ინკუბაცია LYSE უჯრედებისთვის
● ტემპერატურის პარამეტრები ინკუბაციისთვის
განახლებული უჯრედები ინკუბაცია ხდება სპეციფიკურ ტემპერატურაზე, რათა უზრუნველყოს სრული ლიზის უზრუნველსაყოფად. ეს ჩვეულებრივ ხდება 37 ° C- დან 55 ° C- მდე. ზუსტი ტემპერატურა და ხანგრძლივობა შეიძლება განსხვავდებოდეს პროტოკოლის მიხედვით და გამოყენებული დნმ -ის იზოლაციის ნაკრების სპეციფიკური მოთხოვნების მიხედვით.
● ეფექტური ლიზისთვის საჭირო ხანგრძლივობა
ინკუბაციისთვის ტიპიური ხანგრძლივობაა 20 -დან 30 წუთამდე, მაგრამ მისი კორექტირება შესაძლებელია დაფიქსირებული უჯრედების ლიზის ეფექტურობის საფუძველზე. გახანგრძლივებული ინკუბაცია შეიძლება საჭირო გახდეს სრული ლიზისთვის, მაგრამ უნდა იყოს დაბალანსებული დნმ -ის დეგრადაციის რისკის საწინააღმდეგოდ.
გაგრილება ოთახის ტემპერატურაზე
● თანდათანობით გაგრილების მნიშვნელობა
ინკუბაციის შემდეგ, ლიზატი თანდათან გაცივდება ოთახის ტემპერატურაზე. თანდათანობითი გაგრილება ხელს უწყობს დნმ -ის სტაბილიზაციას და ამცირებს თერმული შოკის რისკს, რამაც შესაძლოა დნმ -ის დეგრადაცია.
● ეფექტები დნმ -სა და ფიჭურ ნამსხვრევებზე
ოთახის ტემპერატურაზე გაგრილება საშუალებას აძლევს უჯრედულ ნამსხვრევებს ნალექი, რაც უფრო ადვილი გახდება დნმ -ის განცალკევება მომდევნო ნაბიჯებში. ეს ასევე ხელს უწყობს ფერმენტის საქმიანობის სტაბილიზაციას და ხელს უწყობს რნმ -ის მოცილებას RNase მკურნალობით.
RNase გადაწყვეტის დამატება
● RNase- ის მიზანი პროცედურაში
RNase ხსნარი ემატება დეგრადაციას რნმ -ს, რომელსაც სხვაგვარად შეეძლო CO - გაწმენდის დნმ -ით და ხელი შეუშალოს ქვემო პროგრამებს. RNase შერჩევით იჯობს რნმ -ს, დნმ -ს ხელუხლებელი ტოვებს.
RNA რნმ -ის დაბინძურების თავიდან აცილება
რნმ -ის დაბინძურების თავიდან აცილება გადამწყვეტი მნიშვნელობა აქვს პროგრამებს, რომლებიც საჭიროებენ სუფთა დნმ -ს, მაგალითად PCR და თანმიმდევრობას. RNase მკურნალობა უზრუნველყოფს, რომ იზოლირებული დნმ თავისუფალი იყოს RNA დამაბინძურებლებისგან.
დნმ -ის გაწმენდა
● სხვა ფიჭური კომპონენტებისგან დნმ -ის განცალკევების მეთოდები
რამდენიმე მეთოდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას ლიზატისგან დნმ -ის გასასუფთავებლად. ამაში შედის ფენოლი - ქლოროფორმის მოპოვება, ეთანოლის ნალექი და კომერციული E. coli დნმ -ის ნაკრებების გამოყენება. თითოეულ მეთოდს აქვს თავისი დადებითი და უარყოფითი მხარეები, კომერციული ნაკრებებით გთავაზობთ მოხერხებულობას და თანმიმდევრულ შედეგებს.
● მოსაზრებები დნმ -ის სიწმინდის შესახებ
სიწმინდე გადამწყვეტი ფაქტორია ქვემო დინების პროგრამების წარმატებისთვის. კომერციული ნაკრები, როგორიცაა უჯრედული თერაპია E. coli დნმ -ის ნაკრები, შექმნილია მაღალი - სიწმინდის დნმ -ის მოსაპოვებლად ცილების, ლიპიდების და სხვა დამაბინძურებლების ეფექტურად ამოღებით.
იზოლირებული დნმ -ის შენახვა და მართვა
● საუკეთესო პრაქტიკა დნმ -ის შესანახად
გაწმენდის შემდეგ, დნმ უნდა ინახებოდეს შესაფერისი ბუფერში, მაგალითად TE ბუფერული, - 20 ° C ან - 80 ° C გრძელვადიანი შენახვისთვის. მოერიდეთ ხშირი გაყინვას - დათბობის ციკლები, რადგან მათ შეუძლიათ გამოიწვიოს დნმ -ის დეგრადაცია.
Down დნმ -ის მთლიანობის შენარჩუნება ქვემო პროგრამებისთვის
დნმ -ის მთლიანობის შესანარჩუნებლად, გამოიყენეთ სტერილური, ნუკლეზა - უფასო მილები და გადაწყვეტილებები. ეს უზრუნველყოფს, რომ დნმ რჩება არაკონტაქტირებული და შესაფერისი პროგრამებისთვის, როგორიცაა კლონირება, თანმიმდევრობა და PCR.
გარშემობლუკიტი
Jiangsu Hillgene- მა ჩამოაყალიბა თავისი შტაბი (10,000㎡ GMP მცენარეები და R&D ცენტრი) სუზუში, რომელიც მდებარეობს Wuzhong District- ში, Suzhou- ში, ულამაზესი ტაიჰუს ტბის ტბის ქალაქი და ორი საწარმოო ადგილი Shenzhen- სა და Shanghai- ში, რომელიც აგრძელებს თავის წარმოების ქსელს ქვეყნის მასშტაბით. ჩრდილოეთ კაროლინას ადგილი აშშ -ში ამჟამად მშენებლობის პროცესშია, რაც კიდევ უფრო ავრცელებს მის გლობალურ ყოფნას. ჰილგენმა ააშენა ექსპრეს გზა ფიჭური თერაპიის პროდუქტების განვითარებისთვის, აღმოჩენიდან მიწოდებამდე, ნუკლეინის მჟავების წარმოების პლატფორმებით, შრატში - უფასო შეჩერების კულტივირება, დახურული პროცესის შემუშავება და QC ტესტირება. Bluekit პროდუქტები განკუთვნილია ხარისხის კონტროლისთვის, რაც უზრუნველყოფს ფიჭური თერაპიის ინოვაციების წარმატებას.
პოსტის დრო: 2024 - 09 - 05 14:47:03
