Ngisolasi DNA saka E. Coli minangka prosedur dhasar ing biologi molekular. Artikel iki bakal mlaku sampeyan liwat kabeh proses, nyedhiyakake langkah rinci lan panjelasan, mesthekake sampeyan ngerti babagan ilmu lan aspek praktis prosedur kasebut. Apa sampeyan peneliti panggang utawa anyar kanggo lab, pandhuan iki bakal dadi sumber sing larang regane.
Preparation penundaan sel
● Koleksi Solusi E. COLI
Langkah pertama ing ngisolasi DNA saka E. coli melu ngempalaken sel bakteri. Iki biasane mbutuhake tuwuh e. coli kanthi medium cair sing cocog nganti tekan fase wutah logaritithmic. Wektu penting amarga sel ing fase iki paling apik lan luwih gampang kanggo Lyse, sing bakal ngasilake asil DNA sing luwih dhuwur.
● Sel-sel resuspending ing buffer sing cocog
Sel sing diklumpukake banjur diturunake ing buffer sing cocog. Pilihan sing umum yaiku tris - edta (te) buffer, sing mbantu njaga integritas DNA sajrone proses ekstraksi. Buffer nglayani pirang-pirang tujuan: Iki stabil kasi sing dibungkus ph, nrima kasi sing bisa ngrusak DNA, lan menehi lingkungan ionik sing optimal kanggo reaksi enzim sing optimal kanggo reaksi enzim.
Centrifugation kanggo sel pelet
● Parameter kanggo Centrifugation (kacepetan lan wektu)
Sawise nerusake sel, penundaan kasebut kena centrifugation kanggo pelet sel. Kacepetan centrifugation lan wektu minangka paramèter kritis. Biasane, centrifugation ditindakake udakara 4,000 - 6.000 g kanggo 10 - 15 menit ing 4 ° C. Iki mesthekake yen sel mbentuk pelet sing ketat ing ngisor tabung centrifuge.
● pentinge pelet sing tepat
Pelet sing tepat penting kanggo misahake sel saka wutah medium lan komponen larut liyane. Uga - nggawe pelet nggawe langkah sabanjure luwih gampang lan luwih efisien, njamin sel sel lan, mula, ngasilake DNA maksimal.
Ngilangi Supernatant
● Teknik kanggo Ngilangi Supernatant
Sawise sel kasebut dilatih, supernatant (cairan ing ndhuwur pelet) kudu dicopot kanthi ati-ati tanpa ngganggu pelet sel. Iki biasane ditindakake kanthi nggunakake micropette. Kemenangan kanggo nindakake langkah iki kanthi apik supaya ora kelangan sel.
● Njamin Mundhak Kelet Minimal
Kanggo njamin mundhut pelet sel minimal kalebu pipetting kanthi ati-ati lan, yen perlu, pirang-pirang putaran centrifugation lan supernatat. Tujuane yaiku supaya sel-sel bisa ing pelet kanggo pemulihan DNA maksimal.
Kajaba saka solusi lysis inti
● Komponen solusi lysis nuklir inti
Solusi lysis nuklélei biasane ngemot bahan cuci (kaya SD), buffer (kayata tris - HCL), lan agen chelining (kaya edta). Dection cucentrane ngganggu membran sel lan amplop nuklir, ngeculake konten mRNA, kalebu DNA, dadi solusi.
● Peranan kanggo ngilangi tembok sel mudhun
Solusi lysis nuklélip ora mung nggunakake membran sel nanging uga denatatisasi protein lan lipid, kanthi efektif ngilangi tembok sel lan amplop nuklir kanggo ngeculake DNA menyang solusi.
Resuspensi sel
● Pipetting lembut kanggo ngindhari shearing dna
Sawise solusi lysis inti ditambahake, sel kasebut kudu diterusake kanthi alon-alon supaya ora shearing DNA. Shearing bisa ngilangi DNA dadi fragmen sing luwih cilik, sing bisa dadi masalah kanggo aplikasi hilir sing mbutuhake dhuwur - molekul - Bobot DNA.
● Njamin resuspensi lengkap
Resuspensi lengkap mesthekake yen kabeh sel diluncurake kanthi seragam, maksimal pemulihan DNA. Iki bisa digayuh kanthi pipette utawa vorteks larutan kanthi cepet.
Inkubasi kanggo sel Lyse
● Setelan suhu kanggo inkubasi
Sel-sel resuspended diselupake kanthi suhu tartamtu kanggo njamin lysis lengkap. Iki biasane ditindakake ing 37 ° C nganti 55 ° C. Suhu lan durasi bisa beda-beda gumantung karo protokol lan syarat-syarat khusus kit isolasi DNA sing digunakake.
● Duration dibutuhake kanggo lysis sing efektif
Duration khas kanggo inkubasi antarane 20 nganti 30 menit, nanging bisa diatur adhedhasar efisiensi lysis sel diamati. Inkubasi sing berpanjangan bisa uga perlu kanggo lysis lengkap, nanging kudu seimbang karo risiko degradasi DNA.
Kelangan suhu kamar
● pentinge pendinginan bertahap
Sawise inkubasi, lysate mboko sithik kanggo suhu kamar. Penyejukan bertahap mbantu kanggo stabil DNA lan minimalake risiko kejut termal, sing bisa nyebabake DNA.
● Efek ing DNA lan lebu mRNA
Kelangan suhu kamar ngidini lebu mRNA kanggo nyepetake, supaya luwih gampang misahake DNA ing langkah sabanjure. Iki uga mbantu stabilitas enzim lan nggampangake mbusak RNA kanthi perawatan rnase.
Kajaba saka solusi rnase
● Tujuan rnase ing prosedur kasebut
Solusi rnase ditambahake kanggo ngrusak RNA, sing bisa digunakake ing DNA lan nyedhot aplikasi hilir. Rnase selektif RNA, ninggalake DNA utuh.
● nyegah kontaminasi RNA
Ngalangi kontaminasi RNA penting kanggo aplikasi sing mbutuhake DNA murni, kayata PCR lan urutan. Perawatan rnase mesthekake yen DNA terisolasi bebas saka reraminant RNA.
Purifikasi DNA
● Cara kanggo misahake DNA saka komponen mRNA liyane
Saperangan cara bisa digunakake kanggo ngresiki DNA saka Lysate. Iki kalebu Phenol - Ekstraksi Kloroform, Ethancasi Ethanol, lan nggunakake komersial E. coli DNA Kits. Saben metode duwe pro lan kontra, kanthi kitsing komersial nawakake asil sing cocog lan konsisten.
● pertimbangan kanggo murni DNA
Kemurnian minangka faktor kritis kanggo sukses aplikasi hilir. Kit komersial, kayata terapi sel E. coli dna kit, dirancang kanggo ngasilake - kanthi murni DNA kanthi efektif ngilangi protein, lipid, lan rereged liyane.
Panyimpenan lan nangani dna terpencil
● praktik paling apik kanggo nyimpen DNA
Sawise diresiki, DNA kudu disimpen ing buffer sing cocog, kaya Te Buffer, ing - 20 ° C utawa - 80 ° C kanggo dawa - panyimpenan istilah. Ngindhari beku asring - siklus thaw amarga bisa nyebabake kerusakan DNA.
● Ngramut integritas DNA kanggo aplikasi hilir
Kanggo njaga integritas DNA, nggunakake resik, inti - tabung gratis lan solusi gratis. Iki mesthekake yen DNA tetep ora ana gandhengane lan cocog kanggo aplikasi kayata cloning, urutan, lan PCR.
BabaganBlueKu
Jiangsu Huletan netepake markas (10,000º GMp Tanduran lan Pusat R & D) ing Suzhou, sing ana ing kutha tlaga Taihu sing ayu, lan kutha Pabrik ing Shenzhen lan Shanghai, nyebarake jaringan pabrik nasional. Situs North Carolina ing AS saiki wis konstruksi, luwih nyebar ing ngarsane global. Hillgene wis mbangun jalur ekspres kanggo ngembangake produk terapi selular, saka panemuan kanggo pangiriman, serum - budaya penundaan inuk, pangembangan proses tertutup, lan test qc. Produk BlueKit dirancang kanggo kontrol kualitas, mesthekake sukses inovasi terapi.
Wektu Pos: 2024 - 09 - 05 14:47:03
