בידוד DNA מ- E. coli הוא הליך בסיסי בביולוגיה מולקולרית. מאמר זה יעבור אותך לאורך כל התהליך, ויספק צעדים והסברים מפורטים, ותבטיח שאתה מבין את המדע וגם את ההיבטים המעשיים של ההליך. בין אם אתה חוקר מנוסה או חדש במעבדה, מדריך זה יהיה משאב יקר.
הכנת השעיית התא
● אוסף תאי E. coli
השלב הראשון בבידוד ה- DNA מ- E. coli כרוך באיסוף תאי החיידקים. זה בדרך כלל דורש גידול של E. coli במדיום נוזלי מתאים עד שהוא מגיע לשלב הגידול הלוגריתמי. העיתוי הוא קריטי מכיוון שהתאים בשלב זה הם בר -קיימא ביותר וקלים יותר לניתוח, מה שיביא לתפוקת DNA גבוהה יותר.
● תאים מחליפים מחדש במאגר מתאים
לאחר מכן תאים שנאספו מוחזקים מחדש במאגר מתאים. בחירה נפוצה היא חיץ Tris - Edta (TE), המסייע בשמירה על שלמות ה- DNA במהלך תהליך המיצוי. המאגר משרת מטרות מרובות: הוא מייצב את ה- pH, מצנח קטיונים דו -ערכיים שיכולים להשפיל את ה- DNA, ומספק סביבה יונית אופטימלית לתגובות אנזימטיות שלאחר מכן.
צנטריפוגה לתאי גלולה
● פרמטרים לצנטריפוגה (מהירות וזמן)
לאחר החזרת התאים מחדש, ההשעיה נתונה לצנטריפוגה כדי לגלול את התאים. מהירות צנטריפוגה וזמן הם פרמטרים קריטיים. בדרך כלל, צנטריפוגה מבוצעת בסביבות 4,000 - 6,000 גרם למשך 10 - 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס. זה מבטיח כי התאים יוצרים גלולה הדוקה בתחתית צינור הצנטריפוגה.
● חשיבותה של גלולה תקינה
גלולה נכונה חיונית כדי להפריד בין התאים למדיום הגידול ומרכיבים מסיסים אחרים. גלולה נוצרת באר הופכת את הצעדים הבאים לקלים ויעילים יותר, ומבטיחים אובדן מינימלי של תאים, ולכן תפוקת DNA מקסימאלית.
הסרת Supernatant
● טכניקות להסרת Supernatant
לאחר הגלולה של התאים, יש להסיר בזהירות את הסופר -נפט (הנוזל מעל הגלולה) מבלי להפריע לגלולה התא. זה נעשה בדרך כלל באמצעות מיקרופיפט. חשוב לבצע את הצעד הזה בקפדנות כדי להימנע מאובדן תאים כלשהם.
● הבטחת אובדן מינימלי של גלולת התא
הבטחת אובדן מינימלי של גלולה התא כרוכה בפיזור זהיר, ובמידת הצורך, סבבי צנטריפוגה והסרת סופר -נפט. המטרה היא לשמור על כמה שיותר תאים בגלולה להחלמת DNA מקסימאלית.
תוספת של תמיסת תמונת גרעינים
● רכיבי תמיסת תמונת גרעינים
תמיסת תמונת הגרעינים מכילה בדרך כלל חומר ניקוי (כמו SDS), חיץ (כגון טריס - HCl), וסוכן צ'לציה (כמו EDTA). חומר הניקוי משבש את קרום התא ואת המעטפה הגרעינית, ומשחרר את התוכן הסלולרי, כולל DNA, לתמיסה.
● תפקיד בפירוק קירות התא
תמיסת תמונת הגרעינים לא רק מחזיקה את קרום התא אלא גם מחליקה חלבונים וליפידים, תוך פירוק יעילות של קירות התא ואת מעטפות הגרעין כדי לשחרר DNA לתמיסה.
הפנסיה מחדש של תאים
● פיפטה עדינה כדי להימנע מגזירת DNA
לאחר הוספת תמיסת תמונת הגרעין, יש להשלים מחדש את התאים בעדינות כדי להימנע מגזירת DNA. גזירה יכולה לשבור את ה- DNA לשברים קטנים יותר, שיכולים להיות בעייתיים ליישומים במורד הזרם הדורשים DNA משקל גבוה - מולקולרי.
● הבטחת החייאה מוחלטת
הפנסיה מלאה מבטיחה כי כל התאים הם בעלי אחידים, וממקסמים את התאוששות ה- DNA. ניתן להשיג זאת על ידי פיפטה עדינה או מערבולת של הפיתרון במהירות נמוכה.
דגירה לתאים
● הגדרות טמפרטורה לדגירה
התאים שהושפעו מחדש מודגרים בטמפרטורה ספציפית כדי להבטיח תמוגה מלאה. זה נעשה בדרך כלל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד 55 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה והמשך המדויקים יכולים להשתנות בהתאם לפרוטוקול והדרישות הספציפיות של ערכת בידוד ה- DNA המשמשת.
● משך הזמן הנדרש לתמוגה יעילה
משך הדגירה האופייני הוא בין 20 עד 30 דקות, אך ניתן להתאים אותו על סמך היעילות של תמוגה תאים שנצפתה. דגירה ממושכת עשויה להיות נחוצה לצורך תמוגה מלאה אך יש לאזן אותה כנגד הסיכון להשפלת DNA.
קירור לטמפרטורת החדר
● חשיבות הקירור הדרגתי
לאחר הדגירה, הליזאט מקורר בהדרגה לטמפרטורת החדר. קירור הדרגתי מסייע בייצוב ה- DNA וממזער את הסיכון להלם תרמי, מה שעלול להשפיל את ה- DNA.
● השפעות על DNA ופסולת סלולרית
קירור לטמפרטורת החדר מאפשר לפסולת הסלולרית לזרז, מה שמקל על הפרדת ה- DNA בשלבים הבאים. זה גם עוזר לייצב את פעילויות האנזים ומאפשר את הסרת ה- RNA על ידי טיפול ב- RNase.
תוספת של תמיסת RNase
● מטרת RNase בהליך
תמיסת RNase מתווספת כדי להשפיל את ה- RNA, שאחרת יכול היה לשאת co - לטהר עם ה- DNA ולהפריע ליישומים במורד הזרם. RNase מעכל באופן סלקטיבי RNA, ומשאיר את ה- DNA שלם.
● מניעת זיהום RNA
מניעת זיהום RNA היא קריטית ליישומים הדורשים DNA טהור, כגון PCR ורצף. הטיפול ב- RNase מבטיח כי ה- DNA המבודד נקי מזיהומי RNA.
טיהור ה- DNA
● שיטות להפרדת DNA לרכיבים סלולריים אחרים
ניתן להשתמש במספר שיטות כדי לטהר DNA מהליזאט. אלה כוללים מיצוי כלורופורם של כלורופורם, משקעים אתנול ושימוש בערכות DNA מסחריות של E. coli. לכל שיטה היתרונות והחסרונות שלה, כאשר ערכות מסחריות מציעות נוחות ותוצאות עקביות.
● שיקולים לטוהר DNA
טוהר הוא גורם קריטי להצלחת יישומים במורד הזרם. ערכות מסחריות, כמו טיפול בתאים E. coli DNA ערכה, נועדו להניב DNA גבוה של טוהר על ידי הסרת יעילות של חלבונים, ליפידים ומזהמים אחרים.
אחסון וטיפול ב- DNA מבודד
● שיטות עבודה מומלצות לאחסון DNA
לאחר טיהור, יש לאחסן את ה- DNA במאגר מתאים, כמו חיץ TE, בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או - 80 מעלות צלזיוס לאחסון ארוך - טווח. הימנע מקפאה תכופה - מחזורי הפשרה מכיוון שהם יכולים לגרום להשפלת DNA.
● שמירה על שלמות ה- DNA ליישומים במורד הזרם
כדי לשמור על שלמות ה- DNA, השתמש בסטרילי, גרעין - צינורות ופתרונות בחינם. זה מבטיח כי ה- DNA יישאר ללא זוהר ומתאים ליישומים כמו שיבוט, רצף ו- PCR.
אוֹדוֹתBluekit
ג'יאנגסו הילגן הקימה את המטה שלה (10,000 מפעלי GMP ומרכז מו"פ) בסוז'ואו, הממוקם במחוז ווז'ונג, סוז'ו, עיר לייקשור באגם טאיהו היפה, ושני אתרי ייצור בשנג'ן ובשנגחאי, והרחיב את רשת הייצור שלה. אתר צפון קרוליינה בארה"ב נמצא כעת בבנייה, ומפיץ עוד יותר את נוכחותו הגלובלית. הילגנה בנתה מסלול אקספרס לפיתוח מוצרי טיפול סלולרי, החל מגילוי ועד מסירה, עם פלטפורמות לייצור חומצות גרעין, סרום - טיפוח מתלים חופשי, פיתוח תהליכים סגורים ובדיקת QC. מוצרי Bluekit מיועדים לבקרת איכות, ומבטיחים את ההצלחה של חידושים לטיפול סלולרי.
זמן הודעה: 2024 - 09 - 05 14:47:03
