Að einangra DNA frá E. coli er grundvallaratriði í sameindalíffræði. Þessi grein mun leiða þig í gegnum allt ferlið, veita nákvæmar skref og skýringar og tryggja að þú skiljir bæði vísindin og hagnýta þætti málsmeðferðarinnar. Hvort sem þú ert vanur rannsóknarmaður eða nýliði á rannsóknarstofunni, þá verður þessi handbók dýrmæt auðlind.
Undirbúningur frumusviflausnar
● Söfnun E. coli frumna
Fyrsta skrefið í einangrandi DNA frá E. coli felur í sér að safna bakteríumfrumunum. Þetta þarf venjulega að rækta E. coli í viðeigandi fljótandi miðli þar til hann nær logaritmískum vaxtarstigi. Tímasetningin skiptir sköpum vegna þess að frumur í þessum áfanga eru hagkvæmastar og auðveldari fyrir lyse, sem mun leiða til hærri DNA afraksturs.
● Uppgjafarfrumur í viðeigandi biðminni
Safnaðar frumur eru síðan blandaðar aftur í viðeigandi biðminni. Algengt val er Tris - EDTA (TE) biðminni, sem hjálpar til við að viðhalda heilleika DNA meðan á útdráttarferlinu stendur. Bufferinn þjónar mörgum tilgangi: það stöðugar pH, Chelates tvígildir katjónir sem annars gætu brotið niður DNA og veitir ákjósanlegt jón umhverfi fyrir síðari ensímviðbrögð.
Skilvindu í kögglufrumum
● Breytur fyrir skilvindu (hraði og tími)
Eftir að frumurnar voru lokaðar er sviflausnin sett í skilvindu til að köggla frumurnar. Sentrifugation hraði og tími eru mikilvægar breytur. Venjulega er skilvindu framkvæmd við um 4.000 - 6.000 g í 10 - 15 mínútur við 4 ° C. Þetta tryggir að frumurnar mynda þéttan köggli neðst í skilvindu rörinu.
● Mikilvægi réttrar köggunar
Rétt köggun er nauðsynleg til að aðgreina frumurnar frá vaxtarmiðlinum og öðrum leysanlegum íhlutum. Jæja - mynduð köggla gerir síðari skrefin auðveldari og skilvirkari, tryggir lágmarks tap á frumum og því hámarks DNA afrakstur.
Fjarlæging flotvatns
● Tækni til að fjarlægja flotvatn
Þegar frumurnar hafa verið kögglar verður að fjarlægja flotið (vökvinn fyrir ofan köggluna) vandlega án þess að trufla frumukúluna. Þetta er venjulega gert með því að nota örpípettu. Það er lykilatriði að framkvæma þetta skref vandlega til að forðast að missa allar frumur.
● Að tryggja lágmarks tap á frumukorlu
Að tryggja lágmarks tap á frumupillunni felur í sér vandlega pipetting og, ef nauðsyn krefur, margar umferðir af skilvindu og flotvörn. Markmiðið er að geyma eins margar frumur og mögulegt er í kögglinum fyrir hámarks DNA endurheimt.
Viðbót kjarna lýsingarlausnar
● Hlutir kjarna lýsingarlausnar
Kjarnarlýsingarlausnin inniheldur venjulega þvottaefni (eins og SDS), jafnalausn (eins og Tris - HCl) og klóbindandi efni (eins og EDTA). Þvottaefnið truflar frumuhimnuna og kjarnorku umslagið og losar frumuinnihaldið, þar með talið DNA, í lausnina.
● Hlutverk í því að brjóta niður frumuveggi
Kjarnarlýsingarlausnin lýsir ekki aðeins frumuhimnunni heldur einnig denaturizes prótein og lípíð, brotnar í raun niður frumuveggina og kjarnorkuslög til að losa DNA í lausnina.
Resuspension of Cells
● Mild pipetting til að forðast DNA klippa
Þegar kjarna lýsingarlausninni er bætt við þarf að blandast frumurnar varlega til að forðast DNA -klippingu. Klippa getur brotið DNA í smærri brot, sem geta verið vandmeðfarin fyrir notkun downstream sem krefjast mikils - sameinda - þyngdar DNA.
● Að tryggja fullkominn resuspension
Algjör resuspension tryggir að allar frumur séu lýsaðar jafnt og hámarka DNA endurheimt. Þetta er hægt að ná með mildum pipetting eða hvirfilum lausninni á lágum hraða.
Ræktun í Lyse frumur
● Hitastigsstillingar fyrir ræktun
Frumur sem blandaðar eru eru ræktaðar við ákveðinn hitastig til að tryggja fullkomna lýsingu. Þetta er venjulega gert við 37 ° C til 55 ° C. Nákvæmur hitastig og tímalengd getur verið breytileg eftir samskiptareglum og sértækum kröfum DNA einangrunarbúnaðarins sem notaður er.
● Lengd krafist fyrir árangursríka lýsingu
Dæmigerð tímalengd ræktunar er á bilinu 20 til 30 mínútur, en hægt er að stilla hana út frá skilvirkni frumulýsingar sem sést. Langvarandi ræktun getur verið nauðsynleg til fullkominnar lýsis en ætti að vera í jafnvægi við hættuna á niðurbroti DNA.
Kæling við stofuhita
● Mikilvægi smám saman kælingar
Eftir ræktun er lýsatið smám saman kælt að stofuhita. Smám saman kæling hjálpar til við að koma á stöðugleika DNA og lágmarka hættuna á hitauppstreymi, sem gæti hugsanlega brotið niður DNA.
● Áhrif á DNA og frumu rusl
Kæling við stofuhita gerir frumu ruslinu kleift að fella út, sem gerir það auðveldara að aðgreina DNA í síðari skrefum. Þetta hjálpar einnig til við að koma á stöðugleika ensímstarfsemi og auðveldar fjarlægingu RNA með RNase meðferð.
Viðbót RNase lausnar
● Tilgangur RNase í málsmeðferðinni
RNase lausn er bætt við til að brjóta niður RNA, sem annars gæti samið við DNA og truflað downstream forrit. RNase meltir val á RNA og lætur DNA vera ósnortið.
● Að koma í veg fyrir mengun RNA
Að koma í veg fyrir mengun RNA skiptir sköpum fyrir notkun sem krefst hreint DNA, svo sem PCR og raðgreiningar. RNase meðferðin tryggir að einangrað DNA er laust við RNA mengunarefni.
Hreinsun á DNA
● Aðferðir til að aðgreina DNA frá öðrum frumuhlutum
Hægt er að nota nokkrar aðferðir til að hreinsa DNA úr lýsatinu. Má þar nefna fenól - klóróformútdrátt, úrkomu etanóls og með því að nota E. coli DNA pökkum í atvinnuskyni. Hver aðferð hefur sína kosti og galla, þar sem viðskiptasett býður upp á þægindi og stöðugan árangur.
● Íhugun fyrir DNA hreinleika
Hreinleiki er mikilvægur þáttur fyrir árangur af downstream forritum. Auglýsingasett, svo sem frumumeðferð E. coli DNA sett, eru hannaðir til að skila háu - hreinleika DNA með því að fjarlægja prótein, lípíð og önnur mengun á áhrifaríkan hátt.
Geymsla og meðhöndlun einangraðs DNA
● Bestu starfshættir til að geyma DNA
Þegar búið er að hreinsa ætti DNA að geyma í viðeigandi biðminni, eins og TE jafnalausn, við - 20 ° C eða - 80 ° C fyrir langan - geymslu á tíma. Forðastu tíð frystingu - Þíðingarferli þar sem þær geta valdið niðurbroti DNA.
● Að viðhalda heilleika DNA fyrir downstream forrit
Notaðu dauðhreinsa, kjarna, ókeypis slöngur og lausnir til að viðhalda DNA heiðarleika. Þetta tryggir að DNA er áfram ómengað og hentar fyrir forrit eins og klónun, raðgreiningu og PCR.
UmBluekit
Jiangsu Hillgene stofnaði höfuðstöðvar sínar (10.000㎡ GMP plöntur og R & D Center) í Suzhou, sem staðsett er í Wuzhong -héraði, Suzhou, Lakeshore borg hinnar fallegu Taihu -vatns, og tveimur framleiðslustöðum í Shenzhen og Shanhai, útvíkkaði framleiðslunetið á landsvísu. Norður -Karólínusvæðið í Bandaríkjunum er nú í smíðum og dreifir enn frekar á heimsvísu. Hillgene hefur smíðað hraðbraut til að þróa frumumeðferðarafurðir, frá uppgötvun til afhendingar, með pöllum til kjarnsýruframleiðslu, sermi - Ókeypis fjöðrunarræktun, lokuð þróunarferli og QC prófun. Bluekit vörur eru hannaðar til gæðaeftirlits og tryggja árangur nýsköpunar frumna.
Pósttími: 2024 - 09 - 05 14:47:03
