Mengisolasi DNA dari E. coli adalah prosedur mendasar dalam biologi molekuler. Artikel ini akan memandu Anda melalui seluruh proses, memberikan langkah dan penjelasan terperinci, memastikan Anda memahami sains dan aspek praktis dari prosedur. Apakah Anda seorang peneliti berpengalaman atau pendatang baru di lab, panduan ini akan menjadi sumber yang berharga.
Persiapan suspensi sel
● Pengumpulan sel E. coli
Langkah pertama dalam mengisolasi DNA dari E. coli melibatkan pengumpulan sel bakteri. Ini biasanya membutuhkan pertumbuhan E. coli dalam media cair yang sesuai sampai mencapai fase pertumbuhan logaritmik. Waktunya sangat penting karena sel -sel dalam fase ini paling layak dan lebih mudah untuk dilisiskan, yang akan menghasilkan hasil DNA yang lebih tinggi.
● Resuspending sel dalam buffer yang sesuai
Sel -sel yang dikumpulkan kemudian diresuspensi dalam buffer yang sesuai. Pilihan umum adalah buffer Tris - EDTA (TE), yang membantu mempertahankan integritas DNA selama proses ekstraksi. Buffer melayani berbagai tujuan: ini menstabilkan pH, chelates kation divalen yang dapat menurunkan DNA, dan menyediakan lingkungan ionik yang optimal untuk reaksi enzimatik berikutnya.
Sentrifugasi untuk sel pelet
● Parameter untuk sentrifugasi (kecepatan dan waktu)
Setelah menyadarkan kembali sel -sel, suspensi mengalami sentrifugasi untuk melet sel. Kecepatan dan waktu sentrifugasi adalah parameter penting. Biasanya, sentrifugasi dilakukan sekitar 4.000 - 6.000 g selama 10 - 15 menit pada suhu 4 ° C. Ini memastikan bahwa sel -sel membentuk pelet ketat di bagian bawah tabung centrifuge.
● Pentingnya pelet yang tepat
Pelet yang tepat sangat penting untuk memisahkan sel -sel dari media pertumbuhan dan komponen terlarut lainnya. Pelet yang terbentuk dengan baik membuat langkah -langkah selanjutnya lebih mudah dan lebih efisien, memastikan kehilangan sel minimal dan, oleh karena itu, hasil DNA maksimum.
Penghapusan supernatan
● Teknik untuk menghilangkan supernatan
Setelah sel -sel dipelet, supernatan (cairan di atas pelet) harus dihilangkan dengan hati -hati tanpa mengganggu pelet sel. Ini biasanya dilakukan dengan menggunakan mikropipet. Sangat penting untuk melakukan langkah ini dengan cermat untuk menghindari kehilangan sel apa pun.
● Memastikan kehilangan minimal pelet sel
Memastikan kehilangan minimal dari pelet sel melibatkan pemipaan yang cermat dan, jika perlu, beberapa putaran sentrifugasi dan pemindahan supernatan. Tujuannya adalah untuk menjaga sel sebanyak mungkin dalam pelet untuk pemulihan DNA maksimum.
Penambahan larutan lisis nukleus
● Komponen larutan lisis nukleus
Solusi lisis nukleus biasanya mengandung deterjen (seperti SDS), buffer (seperti Tris - HCl), dan agen pengkelat (seperti EDTA). Deterjen mengganggu membran sel dan amplop nuklir, melepaskan isi seluler, termasuk DNA, ke dalam larutan.
● Peran dalam meruntuhkan dinding sel
Larutan lisis nukleus tidak hanya lises membran sel tetapi juga mendenaturasi protein dan lipid, secara efektif memecah dinding sel dan amplop nuklir untuk melepaskan DNA ke dalam larutan.
Resuspensi sel
● Pipeting lembut untuk menghindari geser DNA
Setelah larutan lisis nukleus ditambahkan, sel -sel perlu diresuspensi dengan lembut untuk menghindari geser DNA. Shearing dapat memecah DNA menjadi fragmen yang lebih kecil, yang dapat bermasalah untuk aplikasi hilir yang membutuhkan DNA dengan berat - molekul tinggi.
● Memastikan resuspensi lengkap
Resuspensi lengkap memastikan bahwa semua sel dilisiskan secara seragam, memaksimalkan pemulihan DNA. Ini dapat dicapai dengan pemipaan lembut atau vortex solusinya dengan kecepatan rendah.
Inkubasi ke sel -sel Lyse
● Pengaturan suhu untuk inkubasi
Sel -sel yang diresuspensi diinkubasi pada suhu tertentu untuk memastikan lisis lengkap. Ini biasanya dilakukan pada suhu 37 ° C hingga 55 ° C. Suhu dan durasi yang tepat dapat bervariasi tergantung pada protokol dan persyaratan spesifik dari kit isolasi DNA yang digunakan.
● Durasi yang diperlukan untuk lisis yang efektif
Durasi khas untuk inkubasi adalah antara 20 hingga 30 menit, tetapi dapat disesuaikan berdasarkan efisiensi lisis sel yang diamati. Inkubasi yang berkepanjangan mungkin diperlukan untuk lisis lengkap tetapi harus diseimbangkan dengan risiko degradasi DNA.
Pendinginan hingga suhu kamar
● Pentingnya pendinginan bertahap
Setelah inkubasi, lisat secara bertahap didinginkan hingga suhu kamar. Pendinginan bertahap membantu menstabilkan DNA dan meminimalkan risiko syok termal, yang berpotensi menurunkan DNA.
● Efek pada DNA dan puing seluler
Pendinginan ke suhu kamar memungkinkan puing -puing seluler untuk mengendap, membuatnya lebih mudah untuk memisahkan DNA dalam langkah -langkah berikutnya. Ini juga membantu menstabilkan aktivitas enzim dan memfasilitasi penghapusan RNA dengan pengobatan RNase.
Penambahan Solusi RNase
● Tujuan RNase dalam prosedur
Solusi RNase ditambahkan untuk menurunkan RNA, yang sebaliknya dapat memurnikan dengan DNA dan mengganggu aplikasi hilir. RNase secara selektif mencerna RNA, meninggalkan DNA utuh.
● Mencegah kontaminasi RNA
Mencegah kontaminasi RNA sangat penting untuk aplikasi yang membutuhkan DNA murni, seperti PCR dan pengurutan. Perawatan RNase memastikan bahwa DNA yang terisolasi bebas dari kontaminan RNA.
Pemurnian DNA
● Metode untuk memisahkan DNA dari komponen seluler lainnya
Beberapa metode dapat digunakan untuk memurnikan DNA dari lisat. Ini termasuk ekstraksi fenol - kloroform, presipitasi etanol, dan menggunakan kit DNA E. coli komersial. Setiap metode memiliki pro dan kontra, dengan kit komersial yang menawarkan kenyamanan dan hasil yang konsisten.
● Pertimbangan untuk kemurnian DNA
Kemurnian adalah faktor penting untuk keberhasilan aplikasi hilir. Kit komersial, seperti terapi sel E. coli DNA kit, dirancang untuk menghasilkan DNA kemurnian tinggi dengan menghilangkan protein, lipid, dan kontaminan lainnya secara efektif.
Penyimpanan dan penanganan DNA yang terisolasi
● Praktik terbaik untuk menyimpan DNA
Setelah dimurnikan, DNA harus disimpan dalam buffer yang sesuai, seperti buffer TE, pada - 20 ° C atau - 80 ° C untuk penyimpanan jangka panjang. Hindari siklus pencairan yang sering dibekukan karena dapat menyebabkan degradasi DNA.
● Mempertahankan integritas DNA untuk aplikasi hilir
Untuk mempertahankan integritas DNA, gunakan steril, nuclease - tabung dan solusi gratis. Ini memastikan bahwa DNA tetap tidak terkontaminasi dan cocok untuk aplikasi seperti kloning, sekuensing, dan PCR.
TentangBluekit
Jiangsu Hillgene mendirikan kantor pusatnya (10.000 ㎡ pabrik GMP dan pusat R&D) di Suzhou, yang terletak di distrik Wuzhong, Suzhou, sebuah kota di tepi danau di Danau Taihu yang indah, dan dua lokasi manufaktur di Shenzhen dan Shanghai, yang memperluas jaringan manufaktur Nasional. Situs North Carolina di AS saat ini sedang dibangun, selanjutnya menyebarkan kehadiran globalnya. Hillgene telah membangun jalur ekspres untuk mengembangkan produk terapi seluler, dari penemuan hingga pengiriman, dengan platform untuk pembuatan asam nukleat, pembiayaan suspensi bebas serum, pengembangan proses tertutup, dan pengujian QC. Produk Bluekit dirancang untuk kontrol kualitas, memastikan keberhasilan inovasi terapi seluler.
Waktu pos: 2024 - 09 - 05 14:47:03
