E. Coli- ից ԴՆԹ-ն մեկուսացված է մոլեկուլային կենսաբանության հիմնարար ընթացակարգը: Այս հոդվածը կուղեկցի ձեզ ամբողջ գործընթացի միջոցով, տրամադրելով մանրամասն քայլեր եւ բացատրություններ, ապահովելով, թե ինչպես եք գիտությունը եւ ընթացակարգի գործնական կողմերը: Անկախ նրանից, թե դուք փորձառու գիտաշխատող եք, թե նոր կոմս, այս ուղեցույցը արժեքավոր ռեսուրս կլինի:
Բջջային կասեցման պատրաստում
● E. Coli բջիջների հավաքածու
E. Coli- ից ԴՆԹ-ի մեկուսացնելու առաջին քայլը ներառում է մանրէային բջիջների հավաքում: Սա սովորաբար պահանջում է աճեցնել E. Coli- ն համապատասխան հեղուկ միջավայրում, մինչեւ հասնի լոգարիթմական աճի փուլ: Ժամկետը շատ կարեւոր է, քանի որ այս փուլում բջիջները առավել կենսունակ են եւ ավելի հեշտ է Լայսի համար, ինչը կհանգեցնի ԴՆԹ-ի ավելի բարձր եկամտի:
● Վերականգնել բջիջները համապատասխան բուֆերով
Հավաքված բջիջները այնուհետեւ վերափոխվում են համապատասխան բուֆերի մեջ: Ընդհանուր ընտրությունը Tris - EDTA (TE) բուֆեր, որն օգնում է պահպանել ԴՆԹ-ի ամբողջականությունը արդյունահանման գործընթացում: Բուֆերը ծառայում է բազմաթիվ նպատակներով. Այն կայունացնում է pH- ն, ցողում է բաժանարար կատիոնները, որոնք այլ կերպ կարող են դանդաղեցնել ԴՆԹ-ն եւ ապահովում են օպտիմալ իոնային միջավայր, հետագա ֆերմենտային ռեակցիաների համար:
Centrafugation to pellet բջիջներ
● Կենտրոնապետության պարամետրեր (արագություն եւ ժամ)
Բջիջները վերականգնելուց հետո կասեցումը ենթարկվում է կենտրոնախումբ բջիջները գնդիկավորելու: Կենտրոնախումբի արագությունն ու ժամանակը կրիտիկական պարամետր են: Սովորաբար, ցենտրիֆուգացումը կատարվում է շուրջ 4000-ի սահմաններում - 6000 գ 10 - 15 րոպե 4 ° C ջերմաստիճանում: Սա ապահովում է, որ բջիջները ձեւավորեն ամուր գնդիկ ցենտրիֆուգի խողովակի ներքեւի մասում:
● Համապատասխան պայթելու կարեւորությունը
Պատշաճ էջը անհրաժեշտ է բջիջները բաժանել աճի միջին եւ լուծվող բաղադրիչներից: Լավ - ձեւավորված գնդիկավորը հետագա քայլերը դարձնում է ավելի հեշտ եւ արդյունավետ, ապահովելով բջիջների նվազագույն կորուստը եւ, հետեւաբար, ԴՆԹ-ի առավելագույն եկամտաբերությունը:
Գերբնական հեռացում
● Գերագույն հեռացման տեխնիկա
Երբ բջիջները գնդիկավորվեն, գերբեռնվածը (գնդիկից վերեւ հեղուկը) պետք է ուշադիր հանվի առանց բջջային գնդիկավորի խանգարման: Դա սովորաբար կատարվում է միկրոպան օգտագործելով: Այս քայլը շատ կարեւոր է `մանրակրկիտ ցանկացած բջիջ կորցնելուց խուսափելու համար:
● Բջջային գնդիկավոր նվազագույն կորստի ապահովում
Բջջային գնդիկավոր նվազագույն կորստի ապահովումն ընդգրկում է զգույշ պղպեղ եւ, անհրաժեշտության դեպքում, կենտրոնախումբի եւ գերբնական հեռացման բազմաթիվ փուլեր: Նպատակը `որքան հնարավոր է շատ բջիջներ պահել գնդիկով` ԴՆԹ-ի առավելագույն վերականգնման համար:
Միջուկային լիզի լուծույթի ավելացում
● Միջուկային լիզի լուծույթի բաղադրիչները
Միջուկային լիզի լուծումը, որպես կանոն, պարունակում է լվացող միջոց (նման SDS), բուֆեր (օրինակ, Tris - HCl), եւ Edta): Լվացող միջոցը խաթարում է բջջային թաղանթը եւ միջուկային ծրարը, թողարկելով բջջային բովանդակությունը, ներառյալ ԴՆԹ-ն, լուծման մեջ:
● դերը բջջային պատերը քանդելու մեջ
Միջուկի լիզի լուծումը ոչ միայն լիզում է բջջային թաղանթը, այլեւ դնում է սպիտակուցներն ու լիպիդները, արդյունավետորեն կոտրելով բջջային պատերը եւ միջուկային ծրարները `լուծույթին ազատելու համար:
Բջիջների վերադառնում
● Նուրբ պղպեղ, ԴՆԹ-ի կտրումից խուսափելու համար
Մի անգամ կորիզի լիզի լուծումը ավելացվի, բջիջները պետք է առնչվեն նրբորեն, ԴՆԹ-ի կտրումից խուսափելու համար: Shearing- ը կարող է կոտրել ԴՆԹ-ն ավելի փոքր բեկորների մեջ, որոնք կարող են խնդրահարույց լինել ներքեւի դիմումների համար, որոնք պահանջում են բարձր - Քաշը ԴՆԹ-ն է:
● Ամբողջական վերափոխման ապահովում
Ամբողջական վերափոխումը ապահովում է, որ բոլոր բջիջները լիզեն համազգեստով, առավելագույնի հասցնելով ԴՆԹ-ի վերականգնումը: Դա հնարավոր է հասնել մեղմ արագությամբ մեղմությամբ պղպեղով կամ պտույտով:
INCUBATION LYSE բջիջներին
● ջերմաստիճանի կարգավորումներ ինկուբացիայի համար
Վերականգնված բջիջները ինկուբացվում են հատուկ ջերմաստիճանում `ամբողջական լիզը ապահովելու համար: Դա սովորաբար կատարվում է 37 ° C- ից մինչեւ 55 ° C ջերմաստիճանում: Temperature երմաստիճանը եւ տեւողությունը կարող են տարբեր լինել `կախված արձանագրությունից եւ օգտագործվում են ԴՆԹ մեկուսացման հանդերձանքի հատուկ պահանջներից:
● Արդյունավետ լիզի համար անհրաժեշտ տեւողությունը
Ինկուբացիայի համար բնորոշ տեւողությունը 20-ից 30 րոպեի ընթացքում է, բայց այն կարող է ճշգրտվել `ելնելով բջջային լիզի ազդեցության վրա: Երկարատեւ ինկուբացիան կարող է անհրաժեշտ լինել ամբողջական լիզի համար, բայց պետք է հավասարակշռված լինի ԴՆԹ-ի դեգրադացիայի ռիսկի դեմ:
Սառչում է սենյակային ջերմաստիճանը
● աստիճանական սառեցման կարեւորությունը
Ինկուբացիայից հետո լիզատը աստիճանաբար սառչում է սենյակային ջերմաստիճանը: Դաժան սառեցումը օգնում է կայունացնել ԴՆԹ-ն եւ նվազագույնի հասցնել ջերմային ցնցումների ռիսկը, ինչը կարող է պոտենցիալ քայքայել ԴՆԹ-ն:
● Էֆեկտներ ԴՆԹ-ի եւ բջջային բեկորների վրա
Սառը ջերմաստիճանի սառեցումը թույլ է տալիս բջջային բեկորները տեղաշարժվել, ավելի հեշտ դարձնելով ԴՆԹ-ն հետագա քայլերով առանձնացնել: Սա նաեւ օգնում է կայունացնել ֆերմենտային գործողությունները եւ հեշտացնում է RNASE բուժման միջոցով RNA- ի հեռացումը:
RSASE լուծման ավելացում
● Ընթացակարգում RSASE նպատակը
Rnase լուծումն ավելացվում է DeGrade RNA- ն, որը այլ կերպ կարող էր համագործակցել ԴՆԹ-ի հետ եւ միջամտել ներքեւի ծրագրերին: Rsase- ն ընտրովի մարսում է RNA- ն, թողնելով ԴՆԹ-ի անձեռնմխելիությունը:
● Կանխում RNA աղտոտումը
RNA աղտոտումը կանխելը շատ կարեւոր է այն ծրագրերի համար, որոնք պահանջում են մաքուր ԴՆԹ, օրինակ, PCR եւ հաջորդականացում: RSASE բուժումը ապահովում է, որ մեկուսացված ԴՆԹ-ն անվճար է RNA աղտոտիչներից:
ԴՆԹ-ի մաքրում
● ԴՆԹ-ն այլ բջջային բաղադրիչներից առանձնացնելու մեթոդներ
Մի քանի մեթոդներ կարող են օգտագործվել լիզատից ԴՆԹ-ն մաքրելու համար: Դրանք ներառում են ֆենոլ - Քլորոֆորմի արդյունահանումը, էթանոլի տեղումները եւ օգտագործելով առեւտրային E. Coli DNA հավաքածուներ: Յուրաքանչյուր մեթոդ ունի իր կողմն ու կողմերը, առեւտրային փաթեթներով, որոնք առաջարկում են հարմարավետություն եւ հետեւողական արդյունքներ:
● նկատառումներ ԴՆԹ մաքրության համար
Մաքուրությունը խիստ կարեւոր գործոն է ներքեւի դիմումների հաջողության համար: Առեւտրային հավաքածուներ, ինչպիսիք են բջջային թերապիան E. Coli DNA Kit- ը, նախագծված են բարձրացնել բարձր - մաքրությունը ԴՆԹ-ն, արդյունավետորեն հեռացնելով սպիտակուցները, լիպիդները եւ այլ աղտոտող նյութեր:
Մեկուսացված ԴՆԹ-ի պահպանում եւ բեռնաթափում
● ԴՆԹ-ի պահման լավագույն փորձերը
Մաքրվելուց հետո ԴՆԹ-ն պետք է պահվի հարմար բուֆեր, ինչպես Te Buffer- ը, - 20 ° C կամ - 80 ° C երկարության համար: Խուսափեք հաճախակի սառեցումից - հալեցրեք ցիկլերը, քանի որ դրանք կարող են առաջացնել ԴՆԹ-ի դեգրադացիա:
● DNA ամբողջականության պահպանում ներքեւի ծրագրերի համար
ԴՆԹ ամբողջականությունը պահպանելու համար օգտագործեք ստերիլ, միջուկային - անվճար խողովակներ եւ լուծումներ: Սա ապահովում է, որ ԴՆԹ-ն մնում է անվերջին եւ հարմար է դիմումների համար, ինչպիսիք են կլոնավորումը, հաջորդականությունը եւ PCR- ն:
ՄոտավորապեսԿապույտ
J իանգսու Հիլգենը ստեղծեց իր շտաբը (10,000㎡ GMP բույսեր եւ R & D կենտրոն) Սուժուում, որը գտնվում է Վուհոնգ թաղամասում, Սուխոյում, Լուխո քաղաքում գտնվող Լուխսոր քաղաքում եւ Շենժենում եւ Շանհայում երկու արտադրական կայքեր, տարածելով իր արտադրական ցանցը: ԱՄՆ-ում Հյուսիսային Կարոլինայի կայքը ներկայումս կառուցման փուլում է, հետագայում տարածելով իր գլոբալ ներկայությունը: Hillgene- ը կառուցել է բջջային թերապիայի արտադրանքների զարգացման հստակ ուղի, հայտնաբերումից մինչեւ առաքում, միջուկաթթու արտադրության պլատֆորմներ, շիճուկ - անվճար կասեցման կուլտուրա: Bluekit արտադրանքը նախատեսված է որակի վերահսկման համար, ապահովելով բջջային թերապիայի նորամուծությունների հաջողությունը:
Ժամը 2024 - 09 - 05 14:47:03
