A DNS izolálása az E. coli -ból alapvető eljárás a molekuláris biológiában. Ez a cikk áttekinti a teljes folyamatot, részletes lépéseket és magyarázatokat adva, biztosítva, hogy megértse mind a tudományt, mind az eljárás gyakorlati szempontjait. Akár tapasztalt kutató, akár a laboratórium újonnan belépője, ez az útmutató értékes erőforrás lesz.
Sejtszuszpenzió előkészítése
● Az E. coli sejtek gyűjtése
A DNS izolálásának első lépése az E. coli -ból magában foglalja a baktériumsejtek gyűjtését. Ehhez általában szükség van az E. coli növelésére egy megfelelő folyékony közegben, amíg el nem éri a logaritmikus növekedési fázist. Az időzítés döntő jelentőségű, mivel az ebben a fázisban a sejtek a legkönnyebben és könnyebben lízisek, ami magasabb DNS -hozamot eredményez.
● A sejtek újraszuszpendálása megfelelő pufferben
Az összegyűjtött sejteket ezután megfelelő pufferben szuszpendálják. Általános választás egy Tris - EDTA (TE) puffer, amely elősegíti a DNS integritásának fenntartását az extrakciós folyamat során. A puffer több célt szolgál: stabilizálja a pH -t, a kelátok kétértékű kationokat, amelyek egyébként lebonthatják a DNS -t, és optimális ionos környezetet biztosítanak a későbbi enzimatikus reakciókhoz.
Centrifugálás pelletsejtekbe
● Paraméterek a centrifugáláshoz (sebesség és idő)
A sejtek újraszuszpendálása után a szuszpenziót centrifugálásnak vetik alá, hogy a sejtek pelletje legyen. A centrifugálási sebesség és az idő kritikus paraméterek. Általában a centrifugálást körülbelül 4000 - 6000 g -nél 10 - 15 percig végezzük 4 ° C -on. Ez biztosítja, hogy a sejtek szoros pelletet képezzenek a centrifugacső alján.
● A megfelelő pelleting fontossága
A megfelelő pelleting elengedhetetlen a sejtek elválasztásához a tápközegtől és más oldható komponensektől. Egy kút - képződött pellet megkönnyíti és hatékonyabbá teszi a következő lépéseket, biztosítva a sejtek minimális veszteségét és ennélfogva a maximális DNS -hozamot.
A felülúszó eltávolítása
● A felülúszó eltávolításának technikái
Miután a sejteket pelletizálják, a felülúszót (a pellet feletti folyadékot) gondosan el kell távolítani anélkül, hogy megzavarnák a sejtpelletet. Ezt általában mikropipetten használják. Alapvető fontosságú, hogy ezt a lépést aprólékosan végezzük el, hogy elkerüljék a sejtek elvesztését.
● A sejtpellet minimális veszteségének biztosítása
A cella pellet minimális veszteségének biztosítása magában foglalja a gondos pipettázást és szükség esetén a centrifugálás és a felülúszó eltávolítás több fordulóját. A cél az, hogy minél több sejtet tartson a pelletben a DNS maximális visszanyerése érdekében.
Nukleáris lízis oldat hozzáadása
● A mag lízis oldat alkotóelemei
A mag lízis -oldat általában mosószert (például SDS), puffert (például Tris - HCl) és kelátképző szert (például EDTA) tartalmaz. A mosószer megzavarja a sejtmembránt és a nukleáris borítékot, és a celluláris tartalmat, beleértve a DNS -t, az oldatba engedi.
● Szerepe a sejtfalak lebontásában
A mag lízis -oldat nemcsak a sejtmembránt lisztozza, hanem denaturizálja a fehérjéket és a lipideket, hatékonyan lebontva a sejtfalakat és a nukleáris borítékokat, hogy a DNS -t felszabadítsák az oldatba.
A sejtek újraszuszpendálása
● Gyengéd pipettázás a DNS -nyírás elkerülése érdekében
Miután a mag lízis oldatot hozzáadják, a sejteket óvatosan kell szuszpendálni, hogy elkerüljék a DNS -nyírást. A nyírás a DNS -t kisebb fragmentumokra bonthatja, amelyek problémás lehetnek azoknál a downstream alkalmazásoknál, amelyek magas - molekuláris - súlyú DNS -t igényelnek.
● A teljes újraszuszpenzió biztosítása
A teljes újraszuszpenzió biztosítja, hogy az összes sejt egyenletesen lizálódjon, maximalizálva a DNS -visszanyerést. Ez elérhető az oldat alacsony sebességgel történő szelíd pipettázásával vagy örvénylésével.
Inkubálás a lyse cellákba
● Hőmérsékleti beállítások az inkubáláshoz
Az újraszuszpendált sejteket egy meghatározott hőmérsékleten inkubáljuk a teljes lízis biztosítása érdekében. Ezt általában 37 ° C -tól 55 ° C -on végzik. A pontos hőmérséklet és időtartam a protokolltól és a használt DNS -izolációs készlet konkrét követelményeitől függően változhat.
● A hatékony lízishez szükséges időtartam
Az inkubálás tipikus időtartama 20-30 perc, de a megfigyelt sejtlízis hatékonysága alapján beállítható. A teljes lízishez hosszabb ideig tartó inkubálásra lehet szükség, de kiegyensúlyozni kell a DNS lebomlásának kockázatát.
Hűtés szobahőmérsékletre
● A fokozatos hűtés fontossága
Inkubálás után a lizátumot fokozatosan szobahőmérsékletre hűtik. A fokozatos hűtés elősegíti a DNS stabilizálását, és minimalizálja a termikus sokk kockázatát, amely potenciálisan lebonthatja a DNS -t.
● A DNS -re és a celluláris törmelékre gyakorolt hatások
A szobahőmérsékletre történő hűtés lehetővé teszi a celluláris törmelék kicsapódását, megkönnyítve a DNS elválasztását a következő lépésekben. Ez elősegíti az enzim aktivitásának stabilizálását és megkönnyíti az RNS -kezeléssel történő eltávolítását.
RNáz -oldat hozzáadása
● Az RNáz célja az eljárásban
Az RNáz -oldatot hozzáadjuk az RNS lebomlásához, amely egyébként megtisztulhat a DNS -sel és zavarja a downstream alkalmazásokat. Az RNáz szelektíven emészti az RNS -t, így a DNS érintetlen marad.
● Az RNS -szennyeződés megelőzése
Az RNS -szennyeződés megelőzése elengedhetetlen az olyan alkalmazásokhoz, amelyek tiszta DNS -t, például PCR -t és szekvenálást igényelnek. Az RNáz -kezelés biztosítja, hogy az izolált DNS mentes legyen az RNS -szennyező anyagoktól.
A DNS tisztítása
● Módszerek a DNS elválasztására más sejtkomponensektől
Számos módszer alkalmazható a DNS tisztítására a lizátumból. Ide tartoznak a fenol - kloroform extrakció, etanol csapadék és kereskedelmi E. coli DNS -készletek felhasználása. Mindegyik módszernek megvannak az előnyei és hátrányai, a kereskedelmi készletek kényelmi és következetes eredményeket kínálnak.
● A DNS tisztaságának megfontolásai
A tisztaság kritikus tényező a downstream alkalmazások sikeréhez. A kereskedelmi készleteket, mint például az E. coli DNS -készlet sejtterápiát, úgy tervezték, hogy magas - tisztaságú DNS -t kapjon a fehérjék, lipidek és más szennyező anyagok hatékony eltávolításával.
Az izolált DNS tárolása és kezelése
● A DNS tárolására szolgáló legjobb gyakorlatok
A tisztítás után a DNS -t megfelelő pufferben, például TE pufferben kell tárolni, - 20 ° C -on vagy - 80 ° C -on hosszú - Kerülje a gyakori fagyasztási ciklusokat, mivel ezek DNS lebomlását okozhatják.
● A DNS -integritás fenntartása a downstream alkalmazásokhoz
A DNS -integritás fenntartásához használjon steril, nukleáz - ingyenes csöveket és oldatokat. Ez biztosítja, hogy a DNS szennyezetlen maradjon és alkalmas olyan alkalmazásokhoz, mint a klónozás, a szekvenálás és a PCR.
KörülbelülBluekit
A Jiangsu Hillgene székhelyét (10 000㎡ GMP növényeket és K + F központot) alapította Suzhou -ban, a Wuzhong kerületben, Suzhou -ban, a gyönyörű Taihu -tó tóparti városában, valamint két Shenzhen és Shanghai gyártóhelye, amely országszerte kibővíti annak gyártási hálózatát. Az Egyesült Államok észak -karolinai helyszíne jelenleg építés alatt áll, tovább terjesztve globális jelenlétét. A Hillgene expressz utat épített fel a sejtterápiás termékek kifejlesztésére, a felfedezéstől a szállításig, a nukleinsav -gyártás platformjaival, a szérum - Ingyenes szuszpenzió -tenyésztés, a zárt folyamatfejlesztés és a QC teszteléssel. A Bluekit termékeket a minőség -ellenőrzésre tervezték, biztosítva a sejtterápiás innovációk sikerét.
A postai idő: 2024 - 09 - 05 14:47:03
