Izole ADN soti nan E. coli se yon pwosedi fondamantal nan biyoloji molekilè. Atik sa a pral mache ou nan tout pwosesis la, bay etap detaye ak eksplikasyon, asire ou konprann tou de syans la ak aspè yo pratik nan pwosedi a. Si ou se yon chèchè sezonman oswa yon Nouvo nan laboratwa a, gid sa a pral yon resous enpòtan.
Preparasyon nan sispansyon selil
● Koleksyon selil E. coli
Premye etap la nan izole ADN soti nan E. coli enplike nan kolekte selil yo bakteri. Sa a anjeneral mande pou ap grandi E. coli nan yon mwayen likid apwopriye jiskaske li rive nan faz nan kwasans logaritmik. Distribisyon an se kritik paske selil nan faz sa a yo pi solid ak pi fasil lyse, ki pral rezilta nan pi wo sede ADN.
● Selil resuspending nan yon zòn de defans ki apwopriye yo
Selil yo kolekte yo Lè sa a, re -sispann nan yon zòn de defans apwopriye. Yon chwa komen se yon tanpon Tris - EDTA (TE), ki ede kenbe entegrite ADN lan pandan pwosesis ekstraksyon an. Tanpon an sèvi plizyè rezon: li estabilize pH la, kelat kasyon divalent ki ta ka otreman degrade ADN, epi li bay yon pi bon anviwònman iyonik pou ki vin apre reyaksyon anzimatik.
Santrifigasyon nan selil plon
● Paramèt pou santrifigasyon (vitès ak tan)
Apre resuspending selil yo, se sispansyon an sibi santrifigasyon nan plon selil yo. Vitès santrifigasyon ak tan yo se paramèt kritik. Tipikman, se santrifigasyon fèt nan alantou 4,000 - 6,000 g pou 10 - 15 minit nan 4 ° C. Sa a asire ke selil yo fòme yon plon sere nan pati anba a nan tib la santrifijez.
● Enpòtans nan granules apwopriye
Pelleting apwopriye se esansyèl nan separe selil yo soti nan medyòm nan kwasans ak lòt konpozan idrosolubl. Yon plon byen - ki te fòme fè etap ki vin apre yo pi fasil ak pi efikas, asire pèt minim nan selil yo, epi, Se poutèt sa, maksimòm ADN sede.
Retire nan Supernatant
● Teknik pou retire supranant
Yon fwa ke selil yo ap grandi, yo dwe retire li (likid ki pi wo a plon an) ak anpil atansyon retire san yo pa twoublan plon selil la. Sa a se anjeneral fè lè l sèvi avèk yon micropipette. Li nan kritik fè etap sa a délikatès pou fè pou evite pèdi nenpòt ki selil yo.
● asire pèt minim nan plon selil
Garanti pèt minim nan rezidi selil la enplike nan pipeting atansyon ak, si sa nesesè, jij miltip nan santrifigasyon ak retire supranant. Objektif la se kenbe selil kòm anpil ke posib nan plon an pou rekiperasyon ADN maksimòm.
Adisyon nan solisyon nwayo lysis
● Eleman nan solisyon nuclei lysis
Solisyon an nwayo lys tipikman gen yon savon (tankou SDS), yon zòn de defans (tankou Tris - HCl), ak yon ajan kelat (tankou EDTA). Detèjan an deranje manbràn selilè a ak anvlòp nikleyè, divilge sa ki selilè, ki gen ladan ADN, nan solisyon an.
● Wòl nan kraze miray selil yo
Solisyon an nwayo lys pa sèlman lis manbràn selilè a, men tou denaturize pwoteyin ak lipid, efektivman kraze desann mi yo selil ak anvlòp nikleyè yo lage ADN nan solisyon an.
Resuspension nan selil yo
● Janti pipetting pou fè pou evite ADN taye lenn
Yon fwa yo ajoute solisyon nwayo a, selil yo bezwen re -sispann dousman pou evite ADN taye lenn. Shearing ka kraze ADN lan nan pi piti fragman, ki ka pwoblèm pou aplikasyon pou en ki mande pou segondè - Molekilè - ADN pwa.
● asire konplè resuspension
Ranpli resuspension asire ke tout selil yo lis egzakteman menm jan, maksimize rekiperasyon ADN. Sa a kapab reyalize pa pipetting dou oswa vortexing solisyon an nan yon vitès ki ba.
Enkubasyon nan selil lyse
● Anviwònman tanperati pou enkubasyon
Selil yo resuspended yo enkubasyon nan yon tanperati espesifik asire lysis konplè. Sa a se anjeneral fè nan 37 ° C a 55 ° C. Tanperati a egzak ak dire ka varye depann sou pwotokòl la ak kondisyon yo espesifik nan twous la izolasyon ADN ke yo te itilize.
● Duration obligatwa pou lysis efikas
Dire a tipik pou enkubasyon se ant 20 a 30 minit, men li ka ajiste ki baze sou efikasite nan lysis selil obsève. Long enkubasyon ka nesesè pou lysis konplè men yo ta dwe balanse kont risk pou yo degradasyon ADN.
Refwadisman nan tanperati chanm
● Enpòtans refwadisman gradyèl
Apre enkubasyon, se lis la piti piti refwadi a tanperati chanm. Gradyèl refwadisman ede nan estabilize ADN lan ak minimize risk pou yo chòk tèmik, ki te kapab potansyèlman degrade ADN lan.
● Efè sou ADN ak debri selilè
Refwadisman nan tanperati chanm pèmèt debri selilè a presipite, fè li pi fasil yo separe ADN lan nan etap sa yo ki vin apre. Sa a ede tou estabilize aktivite yo anzim ak fasilite retire elèv la nan RNA pa tretman RNase.
Adisyon nan solisyon RNase
● Objektif RNase nan pwosedi a
Se solisyon RNase ajoute nan degrade RNA, ki ta ka otreman ko - pirifye ak ADN lan ak entèfere ak aplikasyon pou en. RNase selektivman dijere RNA, kite ADN la entak.
● Anpeche kontaminasyon RNA
Anpeche kontaminasyon RNA enpòtan pou aplikasyon ki mande ADN pi, tankou PCR ak sekans. Tretman RNase a asire ke ADN izole a gratis nan kontaminan RNA.
Pirifye ADN
● Metòd pou separe ADN soti nan lòt konpozan selilè
Plizyè metòd ka itilize pou pirifye ADN nan lis la. Men sa yo enkli fenol - ekstraksyon kloroform, presipitasyon etanòl, ak lè l sèvi avèk komèsyal E. coli ADN twous. Chak metòd gen avantaj li yo ak dezavantaj, ak twous komèsyal ofri konvenyans ak rezilta ki konsistan.
● Konsiderasyon pou pite ADN
Pite se yon faktè kritik pou siksè nan aplikasyon pou en. Twous komèsyal yo, tankou terapi selilè E. coli ADN twous, yo fèt pou bay segondè - ADN pite pa efektivman retire pwoteyin, lipid, ak lòt kontaminan.
Depo ak manyen nan ADN izole
● Pi bon pratik pou estoke ADN
Yon fwa pirifye, yo ta dwe ADN dwe estoke nan yon zòn de defans apwopriye, tankou TE tanpon, nan - 20 ° C oswa - 80 ° C pou lontan - depo tèm. Evite friz souvan - efondreman sik menm jan yo ka lakòz degradasyon ADN.
● Kenbe entegrite ADN pou aplikasyon en
Pou kenbe entegrite ADN, itilize esteril, nuclease - tib gratis ak solisyon yo. Sa a asire ke ADN lan rete san kontwòl ak apwopriye pou aplikasyon pou tankou klonaj, sekans, ak PCR.
DeBluekit
Jiangsu Hillgene etabli katye jeneral li yo (10,000㎡ plant GMP ak R & D sant) nan Suzhou, ki sitiye nan distri a Wuzhong, Suzhou, yon vil Lakeshore nan bèl Taihu Lake a, ak de sit fabrikasyon nan Shenzhen ak Shanghai, pwolonje rezo manifakti li yo nan tout peyi. Sit la North Carolina nan peyi Etazini an se kounye a sou konstriksyon, plis gaye prezans mondyal li yo. Hillgene te bati yon chemen eksprime pou devlope pwodwi terapi selilè, ki soti nan dekouvèt ak livrezon, ak tribin pou manifakti asid nikleyik, serom - Kilti sispansyon gratis, devlopman pwosesis fèmen, ak tès QC. Pwodwi BlueKit yo fèt pou kontwòl kalite, asire siksè nan inovasyon terapi selilè.
Post tan: 2024 - 09 - 05 14:47:03
