Izoliranje DNK iz E. coli temeljni je postupak u molekularnoj biologiji. Ovaj će vas članak provesti kroz cijeli postupak, pružajući detaljne korake i objašnjenja, osiguravajući da razumijete i znanost i praktične aspekte postupka. Bez obzira jeste li iskusni istraživač ili pridošlica u laboratoriju, ovaj će vodič biti vrijedan resurs.
Priprema stanične suspenzije
● Prikupljanje stanica E. coli
Prvi korak u izoliranju DNK iz E. coli uključuje prikupljanje bakterijskih stanica. To obično zahtijeva uzgoj E. coli u prikladnom tekućem mediju dok ne dosegne fazu logaritamskog rasta. Vrijeme je presudno jer su stanice u ovoj fazi održiviji i lakši za lizi, što će rezultirati većim prinosom DNK.
● Resuspendirati stanice u odgovarajućem puferu
Prikupljene stanice zatim se resuspendiraju u odgovarajućem puferu. Uobičajeni izbor je Tris - EDTA (TE) pufer, koji pomaže u održavanju integriteta DNK tijekom procesa ekstrakcije. Pufer služi u više svrha: stabilizira pH, chelateva dvovalentne katione koji bi inače mogli razgraditi DNK i pruža optimalno ionsko okruženje za naknadne enzimske reakcije.
Centrifugiranje u stanice peleta
● Parametri za centrifugiranje (brzina i vrijeme)
Nakon resuspendiranja stanica, suspenzija se podvrgava centrifugiranju da bi stanice peletile. Brzina i vrijeme centrifugiranja kritični su parametri. Obično se centrifugiranje izvodi na oko 4.000 - 6.000 g tijekom 10 - 15 minuta na 4 ° C. To osigurava da stanice formiraju tijesnu pelet na dnu cijevi centrifuge.
● Važnost pravilnog peleta
Pravilno peletiranje je neophodno za odvajanje stanica od medija za rast i drugih topljivih komponenti. Bunar - formirana peleta čini sljedeće korake lakšim i učinkovitijim, osiguravajući minimalni gubitak stanica i, prema tome, maksimalni prinos DNK.
Uklanjanje supernatanta
● Tehnike uklanjanja supernatanta
Jednom kada se stanice peletiraju, supernatant (tekućina iznad peleta) mora se pažljivo ukloniti bez ometanja stanične pelete. To se obično radi pomoću mikropipeta. Ključno je pažljivo izvesti ovaj korak kako biste izbjegli gubitak bilo koje ćelije.
● Osiguravanje minimalnog gubitka stanične pelete
Osiguravanje minimalnog gubitka stanične pelete uključuje pažljivo pipetiranje i, ako je potrebno, višestruki krugovi centrifugiranja i uklanjanje supernatanta. Cilj je zadržati što više stanica u peletu za maksimalni oporavak DNK.
Dodavanje rješenja za lizu jezgara
● Komponente otopine za lizu jezgara
Otopina o liziji jezgara obično sadrži deterdžent (poput SDS -a), pufer (poput Tris - HCl) i helacijsko sredstvo (poput EDTA). Deterdžent ometa staničnu membranu i nuklearnu omotnicu, oslobađajući stanični sadržaj, uključujući DNK, u otopinu.
● Uloga u razbijanju staničnih zidova
Otopina o liziji jezgara ne samo da lizira staničnu membranu, već i denaturizira proteine i lipide, učinkovito razbijajući stanične stijenke i nuklearne omotnice kako bi oslobodio DNK u otopinu.
Resuspendiranje stanica
● Nježno pipedi kako bi se izbjeglo smicanje DNK
Jednom kada se dodaje otopinu za lizu jezgara, stanice se moraju lagano resuspendirati kako bi se izbjeglo šišanje DNK. Osmicanje može razbiti DNK na manje fragmente, što može biti problematično za primjene nizvodno za koje je potrebno visoku - molekularnoj - težini DNK.
● Osiguravanje potpunog resuspenciranja
Potpuna resuspenzija osigurava da se sve stanice ujednače, maksimizirajući oporavak DNK. To se može postići nježnim pipetiranjem ili vrtložnim otopinom malom brzinom.
Inkubacija u Lyse stanice
● Postavke temperature za inkubaciju
Resuspendirane stanice se inkubiraju na određenoj temperaturi kako bi se osigurala potpuna liza. To se obično radi na 37 ° C do 55 ° C. Točna temperatura i trajanje mogu varirati ovisno o protokolu i specifičnim zahtjevima kompleta za izolaciju DNA.
● Trajanje potrebno za učinkovitu lizu
Tipično trajanje inkubacije je između 20 i 30 minuta, ali može se prilagoditi na temelju efikasnosti promatrane stanične lize. Produljena inkubacija može biti potrebna za potpunu lizu, ali trebala bi biti uravnotežena s rizikom od razgradnje DNK.
Hlađenje do sobne temperature
● Važnost postupnog hlađenja
Nakon inkubacije, lizat se postupno hladi na sobnoj temperaturi. Postepeno hlađenje pomaže u stabilizaciji DNK i minimizira rizik od toplinskog šoka, što bi potencijalno moglo razgraditi DNK.
● Učinci na DNK i stanične krhotine
Hlađenje do sobne temperature omogućava taloženje staničnih krhotina, što olakšava odvajanje DNK u sljedećim koracima. To također pomaže u stabilizaciji aktivnosti enzima i olakšava uklanjanje RNA tretmanom RNase.
Dodavanje otopine RNase
● Svrha RNase u postupku
RNase rješenje se dodaje u razgradnju RNA, što bi se u protivnom moglo pročistiti DNK i ometati primjene nizvodno. RNaza selektivno probavlja RNA, ostavljajući DNK netaknutom.
● Sprječavanje onečišćenja RNA
Sprječavanje kontaminacije RNA ključno je za primjene koje zahtijevaju čistu DNK, poput PCR -a i sekvenciranja. Tretman RNase osigurava da izolirana DNK nije onečišćenja RNA.
Pročišćavanje DNK
● Metode odvajanja DNK od drugih staničnih komponenti
Za pročišćavanje DNK iz lizata može se koristiti nekoliko metoda. Oni uključuju fenol - ekstrakciju kloroforma, oborine etanola i korištenje komercijalnih DNK kompleta E. coli. Svaka metoda ima svoje prednosti i nedostatke, a komercijalni setovi nude praktične i dosljedne rezultate.
● Razmatranja čistoće DNK
Čistoća je ključni faktor za uspjeh aplikacija nizvodno. Komercijalni setovi, poput stanične terapije E. coli DNA komplet, dizajnirani su tako da daju visoku - čistoću DNA učinkovito uklanjanjem proteina, lipida i drugih onečišćenja.
Skladištenje i rukovanje izoliranom DNK
● Najbolje prakse za skladištenje DNK
Nakon pročišćene, DNK treba pohraniti u prikladan pufer, poput TE pufera, na - 20 ° C ili - 80 ° C dugi - Izbjegavajte česte smrzavanje - odmrzavanja ciklusa jer mogu uzrokovati razgradnju DNK.
● Održavanje integriteta DNK za aplikacije nizvodno
Da biste održali integritet DNK, koristite sterilne, nuklease - slobodne cijevi i otopine. To osigurava da DNK ostane nekontaminirana i pogodna za primjene poput kloniranja, sekvenciranja i PCR -a.
OkoPlavi
Jiangsu Hillgene osnovao je svoje sjedište (10.000 ㎡ GMP biljke i centar za istraživanje i razvoj) u Suzhouu, smještenom u okrugu Wuzhong, Suzhou, gradu jezera jezera Beautiful Taihu, i dva proizvodna mjesta u Shenzhenu i Šangaju, koja je proširila svoju proizvodnu mrežu. Mjesto Sjeverne Karoline u SAD -u trenutno je u izgradnji, što je dodatno širilo svoju globalnu prisutnost. Hillgene je izgradio ekspresni put za razvoj proizvoda za staničnu terapiju, od otkrića do isporuke, s platformama za proizvodnju nukleinskih kiselina, serum - besplatno kultiviranje ovjesa, razvoj zatvorenog procesa i QC testiranje. Proizvodi Bluekit dizajnirani su za kontrolu kvalitete, osiguravajući uspjeh inovacija mobilne terapije.
Post Vrijeme: 2024 - 09 - 05 14:47:03
