ई। कोलाई से डीएनए को अलग करना आणविक जीव विज्ञान में एक मौलिक प्रक्रिया है। यह लेख आपको पूरी प्रक्रिया के माध्यम से चलाएगा, विस्तृत चरण और स्पष्टीकरण प्रदान करेगा, यह सुनिश्चित करेगा कि आप विज्ञान और प्रक्रिया के व्यावहारिक पहलुओं दोनों को समझेंगे। चाहे आप एक अनुभवी शोधकर्ता हों या प्रयोगशाला के लिए एक नवागंतुक, यह गाइड एक मूल्यवान संसाधन होगा।
सेल निलंबन की तैयारी
● ई। कोलाई कोशिकाओं का संग्रह
ई। कोलाई से डीएनए को अलग करने में पहला कदम बैक्टीरिया कोशिकाओं को एकत्र करना शामिल है। इसके लिए आमतौर पर ई। कोलाई को एक उपयुक्त तरल माध्यम में बढ़ने की आवश्यकता होती है जब तक कि यह लॉगरिदमिक विकास चरण तक नहीं पहुंचता। समय महत्वपूर्ण है क्योंकि इस चरण में कोशिकाएं सबसे व्यवहार्य और लिसे के लिए आसान हैं, जिसके परिणामस्वरूप उच्च डीएनए उपज होगी।
● एक उपयुक्त बफर में resuspending कोशिकाएं
एकत्रित कोशिकाओं को फिर एक उपयुक्त बफर में फिर से तैयार किया जाता है। एक सामान्य विकल्प एक ट्रिस है। EDTA (TE) बफर, जो निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान डीएनए की अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है। बफर कई उद्देश्यों को पूरा करता है: यह पीएच को स्थिर करता है, डिवालेंट उद्धरणों को काटता है जो अन्यथा डीएनए को नीचा कर सकता है, और बाद के एंजाइमैटिक प्रतिक्रियाओं के लिए एक इष्टतम आयनिक वातावरण प्रदान करता है।
गोली कोशिकाओं के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन
● सेंट्रीफ्यूजेशन (गति और समय) के लिए पैरामीटर
कोशिकाओं को फिर से बनाने के बाद, निलंबन को कोशिकाओं को गोली लगाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया जाता है। सेंट्रीफ्यूजेशन की गति और समय महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं। आमतौर पर, centrifugation लगभग 4,000 पर किया जाता है। 10 के लिए 6,000 ग्राम। 4 ° C पर 15 मिनट। यह सुनिश्चित करता है कि कोशिकाएं सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर एक तंग गोली बनाती हैं।
● उचित गोली का महत्व
कोशिकाओं को विकास माध्यम और अन्य घुलनशील घटकों से अलग करने के लिए उचित पेलेटिंग आवश्यक है। एक कुएं - गठित गोली बाद के चरणों को आसान और अधिक कुशल बनाती है, कोशिकाओं के न्यूनतम नुकसान को सुनिश्चित करती है और इसलिए, अधिकतम डीएनए उपज।
सतह पर तैरनेवाला हटाना
● सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए तकनीक
एक बार जब कोशिकाओं को छेड़छाड़ की जाती है, तो सतह पर तैरनेवाला (गोली के ऊपर तरल) को सेल गोली को परेशान किए बिना सावधानी से हटा दिया जाना चाहिए। यह आमतौर पर एक माइक्रोप्रिपेट का उपयोग करके किया जाता है। किसी भी कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए इस कदम को सावधानीपूर्वक करना महत्वपूर्ण है।
● सेल गोली का न्यूनतम नुकसान सुनिश्चित करना
सेल गोली के न्यूनतम नुकसान को सुनिश्चित करने में सावधानीपूर्वक पाइपिंग शामिल है और यदि आवश्यक हो, तो अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने के कई दौर। लक्ष्य अधिकतम डीएनए रिकवरी के लिए गोली में अधिक से अधिक कोशिकाओं को रखना है।
नाभिक lysis समाधान का जोड़
● नाभिक lysis समाधान के घटक
नाभिक lysis समाधान में आम तौर पर एक डिटर्जेंट (जैसे एसडीएस), एक बफर (जैसे कि ट्रिस - एचसीएल), और एक चेलेटिंग एजेंट (जैसे ईडीटीए) होता है। डिटर्जेंट सेल झिल्ली और परमाणु लिफाफे को बाधित करता है, डीएनए सहित सेलुलर सामग्री को जारी करता है, समाधान में।
● सेल की दीवारों को तोड़ने में भूमिका
नाभिक lysis समाधान न केवल कोशिका झिल्ली को प्यार करता है, बल्कि प्रोटीन और लिपिड को भी अलग करता है, प्रभावी रूप से कोशिका की दीवारों और परमाणु लिफाफे को डीएनए को समाधान में छोड़ने के लिए टूट जाता है।
कोशिकाओं का पुनरुत्थान
● डीएनए शीयरिंग से बचने के लिए कोमल पाइपिंग
एक बार नाभिक lysis समाधान जोड़ने के बाद, कोशिकाओं को डीएनए कतरनी से बचने के लिए धीरे से resuspended किया जाना चाहिए। शीयरिंग डीएनए को छोटे टुकड़ों में तोड़ सकता है, जो कि डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए समस्याग्रस्त हो सकता है जिनकी उच्च आवश्यकता होती है। आणविक - वजन डीएनए।
● पूर्ण resuspension सुनिश्चित करना
पूर्ण resuspension यह सुनिश्चित करता है कि सभी कोशिकाओं को समान रूप से lysed किया जाता है, जिससे डीएनए वसूली अधिकतम हो जाती है। यह कम गति से समाधान को कोमल पिपेटिंग या भंवर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
लिसी कोशिकाओं को ऊष्मायन
● ऊष्मायन के लिए तापमान सेटिंग्स
पूर्ण lysis सुनिश्चित करने के लिए resuspended कोशिकाओं को एक विशिष्ट तापमान पर ऊष्मायन किया जाता है। यह आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस से 55 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है। सटीक तापमान और अवधि प्रोटोकॉल और डीएनए अलगाव किट की विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर भिन्न हो सकती है।
● प्रभावी lysis के लिए आवश्यक अवधि
ऊष्मायन के लिए विशिष्ट अवधि 20 से 30 मिनट के बीच होती है, लेकिन इसे सेल lysis की दक्षता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। लंबे समय तक ऊष्मायन पूर्ण lysis के लिए आवश्यक हो सकता है लेकिन डीएनए गिरावट के जोखिम के खिलाफ संतुलित होना चाहिए।
कमरे के तापमान पर ठंडा करना
● क्रमिक शीतलन का महत्व
ऊष्मायन के बाद, lysate धीरे -धीरे कमरे के तापमान पर ठंडा हो जाता है। क्रमिक शीतलन डीएनए को स्थिर करने में मदद करता है और थर्मल शॉक के जोखिम को कम करता है, जो संभावित रूप से डीएनए को नीचा दिखाता है।
● डीएनए और सेलुलर मलबे पर प्रभाव
कमरे के तापमान को ठंडा करने से सेलुलर मलबे को अवक्षेपित करने की अनुमति मिलती है, जिससे बाद के चरणों में डीएनए को अलग करना आसान हो जाता है। यह एंजाइम गतिविधियों को स्थिर करने में भी मदद करता है और RNase उपचार द्वारा RNA को हटाने की सुविधा देता है।
RNase समाधान का जोड़
● प्रक्रिया में RNase का उद्देश्य
RNase समाधान को RNA को नीचा दिखाने के लिए जोड़ा जाता है, जो अन्यथा सह हो सकता है। डीएनए के साथ शुद्ध करें और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के साथ हस्तक्षेप करें। RNase चुनिंदा रूप से RNA को पचाता है, जिससे डीएनए बरकरार होता है।
● आरएनए संदूषण को रोकना
आरएनए संदूषण को रोकना उन अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है जिन्हें शुद्ध डीएनए की आवश्यकता होती है, जैसे कि पीसीआर और अनुक्रमण। RNase उपचार यह सुनिश्चित करता है कि पृथक डीएनए RNA संदूषकों से मुक्त है।
डीएनए की शुद्धि
● अन्य सेलुलर घटकों से डीएनए को अलग करने के तरीके
लिसेट से डीएनए को शुद्ध करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। इनमें फिनोल - क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण, इथेनॉल वर्षा और वाणिज्यिक ई। कोलाई डीएनए किट का उपयोग करना शामिल है। प्रत्येक विधि में अपने पेशेवरों और विपक्ष होते हैं, जिसमें वाणिज्यिक किट सुविधा और सुसंगत परिणाम प्रदान करते हैं।
● डीएनए शुद्धता के लिए विचार
डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों की सफलता के लिए शुद्धता एक महत्वपूर्ण कारक है। वाणिज्यिक किट, जैसे कि सेल थेरेपी ई। कोलाई डीएनए किट, को उच्च उपज के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रोटीन, लिपिड और अन्य संदूषकों को प्रभावी ढंग से हटाकर शुद्धता डीएनए।
पृथक डीएनए का भंडारण और हैंडलिंग
● डीएनए के भंडारण के लिए सर्वोत्तम अभ्यास
एक बार शुद्ध हो जाने के बाद, डीएनए को एक उपयुक्त बफर में संग्रहीत किया जाना चाहिए, जैसे ते बफर, पर। 20 ° C या - 80 ° C लंबे समय के लिए। टर्म स्टोरेज। बार -बार फ्रीज से बचें - पिघलना चक्र क्योंकि वे डीएनए गिरावट का कारण बन सकते हैं।
● डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए डीएनए अखंडता बनाए रखना
डीएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए, बाँझ, न्यूक्लिज़ का उपयोग करें - मुफ्त ट्यूब और समाधान। यह सुनिश्चित करता है कि डीएनए क्लोनिंग, अनुक्रमण और पीसीआर जैसे अनुप्रयोगों के लिए अनियंत्रित और उपयुक्त बना हुआ है।
के बारे मेंब्लूकिट
जियांगसू हिलगीन ने सूज़ोंग जिले में स्थित सूज़ो में स्थित अपने मुख्यालय (10,000 gm जीएमपी पौधे और आर एंड डी सेंटर) की स्थापना की, जो कि सुंदर ताईहू झील के एक लाकेशोर शहर, और शेन्ज़ेन और शांघाई में दो विनिर्माण स्थलों का निर्माण करते हैं, जो अपने निर्माण नेटवर्क नेशनवाइड का विस्तार करते हैं। अमेरिका में उत्तरी कैरोलिना साइट वर्तमान में निर्माणाधीन है, आगे अपनी वैश्विक उपस्थिति को फैला रहा है। Hillgene ने सेलुलर थेरेपी उत्पादों को विकसित करने के लिए एक एक्सप्रेस मार्ग का निर्माण किया है, डिस्कवरी से डिलीवरी तक, न्यूक्लिक एसिड विनिर्माण, सीरम के लिए प्लेटफार्मों के साथ। फ्री सस्पेंशन कल्चरिंग, क्लोज्ड प्रोसेस डेवलपमेंट और क्यूसी परीक्षण। ब्लूकिट उत्पादों को गुणवत्ता नियंत्रण के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो सेलुलर थेरेपी नवाचारों की सफलता सुनिश्चित करता है।
पोस्ट समय: 2024 - 09 - 05 14:47:03
