O illamento do ADN de E. coli é un procedemento fundamental na bioloxía molecular. Este artigo percorrerá todo o proceso, proporcionando pasos e explicacións detalladas, asegurando que entendes tanto a ciencia como os aspectos prácticos do procedemento. Se vostede é un investigador experimentado ou un recén chegado ao laboratorio, esta guía será un valioso recurso.
Preparación da suspensión celular
● Colección de células de E. coli
O primeiro paso para illar o ADN de E. coli implica recoller as células bacterianas. Isto normalmente require cultivar E. coli nun medio líquido adecuado ata chegar á fase de crecemento logarítmico. O calendario é crucial porque as células desta fase son máis viables e máis fáciles de LYSE, o que producirá un maior rendemento do ADN.
● Células reanudando nun búfer adecuado
A continuación, as células recollidas son resuspendidas nun tampón adecuado. Unha elección común é un tampón Tris - EDTA (TE), que axuda a manter a integridade do ADN durante o proceso de extracción. O tampón serve múltiples propósitos: estabiliza o pH, quela os catións divalentes que doutro xeito poderían degradar o ADN e proporciona un ambiente iónico óptimo para reaccións enzimáticas posteriores.
Centrifugación ás células de pellets
● Parámetros para a centrifugación (velocidade e tempo)
Despois de resolver as células, a suspensión está sometida a centrifugación para pelar as células. A velocidade de centrifugación e o tempo son parámetros críticos. Normalmente, a centrifugación realízase ao redor de 4.000 - 6.000 g durante 10 - 15 minutos a 4 ° C. Isto garante que as células forman un pellet axustado na parte inferior do tubo de centrífuga.
● Importancia dun peluche adecuado
O pelleting adecuado é esencial para separar as células do medio de crecemento e outros compoñentes solubles. Un pellet de pozo formado fai que os pasos posteriores sexan máis fáciles e eficientes, garantindo unha perda mínima de células e, polo tanto, o rendemento máximo do ADN.
Eliminación do sobrenadante
● Técnicas para a eliminación do sobrenadante
Unha vez que as células están peladas, o sobrenadante (o líquido por encima do pellet) debe ser eliminado con coidado sen perturbar o pellet celular. Normalmente faise usando unha micropipeta. É crucial realizar este paso minuciosamente para evitar perder células.
● Garantir unha perda mínima de pellet celular
Garantir a perda mínima do pellet celular implica un canalización coidadosa e, se é necesario, múltiples roldas de centrifugación e eliminación de sobrenadantes. O obxectivo é manter o maior número de células posibles no pellet para a máxima recuperación do ADN.
Adición de solución de lise de núcleos
● Compoñentes da solución de lise de núcleos
A solución de lise de núcleos contén normalmente un deterxente (como SDS), un tampón (como Tris - HCl) e un axente quelante (como EDTA). O deterxente perturba a membrana celular e a envoltura nuclear, liberando o contido celular, incluído o ADN, na solución.
● Papel na descomposición das paredes celulares
A solución de lise de núcleos non só lises a membrana celular, senón que tamén desnaturiza as proteínas e os lípidos, rompendo efectivamente as paredes celulares e os sobres nucleares para liberar o ADN na solución.
Resuspensión de células
● Pipeteo suave para evitar o cizallamento do ADN
Unha vez que se engade a solución de lise de núcleos, as células deben ser resuspendidas suavemente para evitar o cizallamento do ADN. A cizalladura pode romper o ADN en fragmentos máis pequenos, que poden ser problemáticos para aplicacións descendentes que requiren un ADN de peso alto - Molecular.
● Garantir a resuspensión completa
A resuspensión completa asegura que todas as células están lisadas de xeito uniforme, maximizando a recuperación do ADN. Isto pódese conseguir mediante un gasto suave ou vortexando a solución a pouca velocidade.
Incubación a células LYSE
● Axustes de temperatura para a incubación
As células resuspendidas son incubadas a unha temperatura específica para garantir a lise completa. Normalmente faise a 37 ° C a 55 ° C. A temperatura e a duración exactos poden variar segundo o protocolo e os requisitos específicos do kit de illamento do ADN que se está a usar.
● Duración necesaria para a lise efectiva
A duración típica para a incubación é de entre 20 e 30 minutos, pero pódese axustar en función da eficiencia da lise celular observada. Pode ser necesaria unha incubación prolongada para a lise completa, pero debe equilibrarse fronte ao risco de degradación do ADN.
Refrixeración a temperatura ambiente
● Importancia do arrefriamento gradual
Despois da incubación, o lisato é arrefriado gradualmente a temperatura ambiente. O arrefriamento gradual axuda a estabilizar o ADN e minimiza o risco de choque térmico, o que podería degradar o ADN.
● Efectos sobre o ADN e os restos celulares
O arrefriamento á temperatura ambiente permite que os restos celulares precipitan, facilitando a separación do ADN nos pasos posteriores. Isto tamén axuda a estabilizar as actividades do encima e facilita a eliminación do ARN mediante tratamento con RNase.
Adición de solución RNase
● Finalidade de RNase no procedemento
A solución RNase engádese para degradar o ARN, que doutro xeito podería co - purificar co ADN e interferir coas aplicacións descendentes. RNase dixeriu selectivamente o ARN, deixando o ADN intacto.
● Previr a contaminación do ARN
Prevenir a contaminación do ARN é crucial para as aplicacións que requiren ADN puro, como PCR e secuenciación. O tratamento con RNase asegura que o ADN illado está libre de contaminantes de ARN.
Purificación do ADN
● Métodos para separar o ADN doutros compoñentes celulares
Pódense usar varios métodos para purificar o ADN do lisato. Estes inclúen a extracción de fenol - Extracción de cloroformo, precipitación de etanol e utilización de kits comerciais de ADN de E. coli. Cada método ten os seus pros e contras, con kits comerciais que ofrecen comodidade e resultados consistentes.
● Consideracións para a pureza do ADN
A pureza é un factor crítico para o éxito das aplicacións descendentes. Os kits comerciais, como o kit de ADN de terapia celular E. coli, están deseñados para producir ADN de alta pureza eliminando eficazmente as proteínas, os lípidos e outros contaminantes.
Almacenamento e manipulación do ADN illado
● As mellores prácticas para almacenar o ADN
Unha vez purificado, o ADN debe almacenarse nun tampón adecuado, como o tampón TE, a - 20 ° C ou - 80 ° C para o almacenamento a longo prazo. Evite a conxelación frecuente - Ciclos de descongelación xa que poden causar a degradación do ADN.
● Manter a integridade do ADN para aplicacións descendentes
Para manter a integridade do ADN, use tubos e solucións estériles, nucleasas - libres. Isto garante que o ADN permaneza non contaminado e adecuado para aplicacións como clonación, secuenciación e PCR.
SobreBlueKit
Jiangsu Hillgene estableceu a súa sede (plantas de 10.000 º GMP e centro de I + D) en Sughou, situada no distrito de Wuzhong, Suzhou, unha cidade de Lakeshore da fermosa lago Taihu e dous sitios de fabricación en Shenzhen e Shanghai, estendendo a súa rede de fabricación. O xacemento de Carolina do Norte nos Estados Unidos está actualmente en construción, difundindo aínda máis a súa presenza global. Hillgene construíu unha vía expresa para desenvolver produtos de terapia celular, desde o descubrimento ata a entrega, con plataformas para a fabricación de ácido nucleico, o cultivo de suspensión libre, o desenvolvemento de procesos pechados e as probas de QC. Os produtos BlueKit están deseñados para o control de calidade, garantindo o éxito das innovacións da terapia celular.
Tempo de publicación: 2024 - 09 - 05 14:47:03
