Is nós imeachta bunúsach é DNA a leithlisiú ó E. coli i mbitheolaíocht mhóilíneach. Rachaidh an t -alt seo leat tríd an bpróiseas iomlán, ag soláthar céimeanna agus mínithe mionsonraithe, ag cinntiú go dtuigeann tú an eolaíocht agus na gnéithe praiticiúla den nós imeachta. Cibé an bhfuil tú i do thaighdeoir seasoned nó ina núíosach don saotharlann, beidh an treoir seo ina acmhainn luachmhar.
Ullmhú fionraí cille
● Bailiú cealla E. coli
Is é an chéad chéim chun DNA a leithlisiú ó E. coli ná na cealla baictéaracha a bhailiú. Éilíonn sé seo de ghnáth E. coli atá ag fás i meán oiriúnach leachtach go dtí go sroicheann sé an chéim fáis logartamach. Tá an t -am ríthábhachtach toisc go bhfuil na cealla sa chéim seo an -inmharthana agus níos éasca le Lyse, rud a mbeidh toradh DNA níos airde mar thoradh air.
● Cealla a athbheochan i maolán cuí
Athchóirítear cealla bailithe ansin i maolán oiriúnach. Is é an rogha choiteann ná maolán Tris - EDTA (TE), a chuidíonn le sláine an DNA a choinneáil le linn an phróisis eastósctha. Freastalaíonn an maolán ar ilchuspóirí: cobhsaíonn sé an pH, chelates divalent a d'fhéadfadh a bheith ag díghrádú DNA ar shlí eile, agus soláthraíonn sé timpeallacht ianach is fearr le haghaidh imoibrithe einsímeacha ina dhiaidh sin.
Lártheifneoiriú do chealla millíní
● Paraiméadair le haghaidh lártheifneoireachta (luas agus am)
Tar éis na cealla a athbheochan, cuirtear lártheifneoiriú ar an bhfionraí chun na cealla a mhilleadh. Is paraiméadair chriticiúla iad luas agus am lártheifneoireachta. De ghnáth, déantar lártheifneoiriú ag thart ar 4,000 - 6,000 g ar feadh 10 - 15 nóiméad ag 4 ° C. Cinntíonn sé seo go gcruthaíonn na cealla millíní daingean ag bun an fheadáin lártheifneora.
● Tábhacht an millíní cuí
Tá millíní cuí riachtanach chun na cealla a dheighilt ón meán fáis agus ó chomhpháirteanna intuaslagtha eile. Déanann toibreacha - millíní foirmithe na céimeanna ina dhiaidh sin níos éasca agus níos éifeachtaí, rud a chinntíonn caillteanas íosta na gceall agus, dá bhrí sin, an toradh uasta DNA.
Deireadh a chur le supernatant
● Teicnící maidir le baint supernatant
Nuair a bhíonn na cealla millte, ní mór an supernatant (an leacht os cionn an millíní) a bhaint go cúramach gan cur isteach ar an millín cille. Déantar é seo de ghnáth ag baint úsáide as micropipette. Tá sé ríthábhachtach an chéim seo a dhéanamh go cúramach chun aon chealla a chailliúint.
● Caillteanas íosta millíní cille a chinntiú
Is éard atá i gceist le caillteanas íosta an millíní cille ná píopaí cúramach a dhéanamh agus, más gá, ilchuideachtaí lártheifneoireachta agus baint supernatant. Is é an sprioc an oiread cealla agus is féidir a choinneáil sa millín le haghaidh aisghabháil uasta DNA.
Réiteach Lysis Núicléas a Chur Leis
● Comhpháirteanna de thuaslagán lysis núicléas
De ghnáth bíonn glantach (cosúil le SDS) sa tuaslagán lysis núicléas, maolán (mar Tris - HCl), agus gníomhaire chelating (cosúil le EDTA). Cuireann an glantach isteach ar an gclúdach cille agus ar an gclúdach núicléach, ag scaoileadh na n -ábhar ceallach, lena n -áirítear DNA, isteach sa tuaslagán.
● Ról i gcillbhallaí a bhriseadh síos
Ní hamháin go gcuireann an tuaslagán lysis núicléas an cill -scannán i leataobh ach déanann sé próitéiní agus lipidí a dhínádúrú freisin, ag briseadh síos na mballaí cille agus na gclúdaigh núicléacha go héifeachtach chun DNA a scaoileadh isteach sa tuaslagán.
Athsholáthar na gceall
● Pípéad milis chun lomadh DNA a sheachaint
Nuair a chuirtear an tuaslagán lysis núicléas leis, ní mór na cealla a athbhunú go réidh chun lomadh DNA a sheachaint. Is féidir le sceitheadh an DNA a bhriseadh ina bhloic níos lú, rud a d'fhéadfadh a bheith ina fhadhb d'iarratais iartheachtacha a dteastaíonn DNA ardmhóilíneach uathu.
● Athchóiriú iomlán a chinntiú
Cinntíonn an t -athsheoladh iomlán go ndéantar na cealla go léir a lysed go haonfhoirmeach, ag uasmhéadú aisghabháil DNA. Is féidir é seo a bhaint amach trí phíopáil mhín nó trí an tuaslagán a vortexing ar luas íseal.
Goir go cealla Lyse
● Socruithe teochta le haghaidh goir
Déantar na cealla athraithe a ghoradh ag teocht ar leith chun lysis iomlán a chinntiú. Déantar é seo de ghnáth ag 37 ° C go 55 ° C. Is féidir leis an teocht agus an ré bheacht a bheith éagsúil ag brath ar an bprótacal agus ar riachtanais shonracha an trealamh aonraithe DNA atá á úsáid.
● Fad a theastaíonn le haghaidh lysis éifeachtach
Is é an fad tipiciúil le haghaidh goir idir 20 agus 30 nóiméad, ach is féidir é a choigeartú bunaithe ar éifeachtúlacht lysis cille a breathnaíodh. D'fhéadfadh go mbeadh goir fhada riachtanach le haghaidh lysis iomlán ach ba chóir é a chothromú i gcoinne an riosca díghrádaithe DNA.
Fuarú go teocht an tseomra
● Tábhacht fuaraithe de réir a chéile
Tar éis goir, déantar an lysate a fhuarú de réir a chéile go teocht an tseomra. Cuidíonn fuarú de réir a chéile leis an DNA a chobhsú agus laghdaíonn sé an baol turraing teirmeach, a d'fhéadfadh an DNA a dhíghrádú.
● Éifeachtaí ar DNA agus smionagar ceallach
Ligeann fuarú go teocht an tseomra don smionagar ceallach deascán a dhéanamh, rud a chiallaíonn go bhfuil sé níos éasca an DNA a dheighilt sna céimeanna ina dhiaidh sin. Cuidíonn sé seo freisin leis na gníomhaíochtaí einsímí a chobhsú agus éascaíonn sé deireadh a chur le RNA trí chóireáil RNase.
Réiteach RNase a chur leis
● Cuspóir an RNase sa nós imeachta
Cuirtear tuaslagán RNase leis an RNA a dhíghrádú, rud a d'fhéadfadh a bheith ag caint leis an DNA agus a chuirfeadh isteach ar iarratais iartheachtacha. RNase a dhíleá go roghnach RNA, ag fágáil an DNA slán.
● Éilliú RNA a chosc
Tá cosc a chur ar éilliú RNA ríthábhachtach d'iarratais a dteastaíonn DNA íon uathu, amhail PCR agus seicheamhú. Cinntíonn an chóireáil RNase go bhfuil an DNA iargúlta saor ó ábhar salaithe RNA.
Íonú DNA
● Modhanna chun DNA a dheighilt ó chomhpháirteanna ceallacha eile
Is féidir roinnt modhanna a úsáid chun DNA a íonú ón lysate. Ina measc seo tá feanól - eastóscadh clóraform, deascadh eatánóil, agus trealamh DNA tráchtála E. coli a úsáid. Tá buntáistí agus míbhuntáistí ag baint le gach modh, le fearais tráchtála ag tairiscint áise agus torthaí comhsheasmhacha.
● Breithnithe le haghaidh íonacht DNA
Is fachtóir ríthábhachtach é íonacht do rath na n -iarratas iartheachtach. Tá trealamh tráchtála, mar shampla an teiripe cille E. coli DNA paca, deartha chun DNA ard -íonachta a fháil trí phróitéiní, lipidí, agus ábhair shalaithe eile a bhaint go héifeachtach.
DNA iargúlta a stóráil agus a láimhseáil
● Dea -chleachtais chun DNA a stóráil
Nuair a bheidh sé íonaithe, ba chóir DNA a stóráil i maolán oiriúnach, cosúil le maolán TE, ag - 20 ° C nó - 80 ° C le haghaidh stórála téarma fada. Seachain reo go minic - timthriallta leáite mar is féidir leo díghrádú DNA a chur faoi deara.
● Ionracas DNA a chothabháil le haghaidh feidhmeanna iartheachtacha
Chun sláine DNA a choinneáil, bain úsáid as steiriúil, nuclease - feadáin agus réitigh saor in aisce. Cinntíonn sé seo go bhfanann an DNA neamhthruaillithe agus oiriúnach d'iarratais ar nós clónáil, seicheamhú, agus PCR.
Thart arGorm kunt
Bhunaigh Jiangsu Hillgene a cheanncheathrú (10,000㎡ plandaí DCD agus Ionad T&F) i Suzhou, atá suite i gceantar Wuzhong, Suzhou, cathair loch de Loch álainn Taihu, agus dhá shuíomh déantúsaíochta i Shenzhen agus Shanghai, ag leathnú a líonra déantúsaíochta ar fud na tíre. Tá suíomh Carolina Thuaidh sna Stáit Aontaithe á dtógáil faoi láthair, ag scaipeadh a láithreachta domhanda a thuilleadh. Tá cosán sainráite tógtha ag Hillgene chun táirgí teiripe cheallacha a fhorbairt, ó fhionnachtain go seachadadh, le hardáin le haghaidh déantúsaíochta aigéid núicléasaigh, serum - saothrú fionraí saor in aisce, forbairt próisis dúnta, agus tástáil QC. Tá táirgí BlueKit deartha le haghaidh rialú cáilíochta, ag cinntiú go n -éireoidh le nuálaíochtaí teiripe cheallacha.
Am Post: 2024 - 09 - 05 14:47:03
