Isolearje DNA fan E. Coli is in fûnemintele proseduere yn molekulêre biology. Dit artikel sil jo troch it heule proses rinne, detaillearre stappen en ferklearrings leverje, har soargje dat jo sawol de wittenskip ferstean as de praktyske aspekten fan 'e proseduere. Oft jo in seizoens ûndersykje as in nijkommer as in nijkommend oan it lab, dizze hantlieding sil in weardefol boarne wêze.
Tarieding fan sel ophinging
● Samling fan E. Coli-sellen
De earste stap yn Isolearje DNA fan E. Coli omfettet de baktearjele sellen te sammeljen. Dit fereasket normaal te groeien E. Coli yn in geskikte floeibere medium oant it de logaritmyske groei-faze berikt. De timing is krúsjaal om't sellen yn dizze faze it meast libbensfetber en makliker binne om te lyse, dy't sil resultearje yn hegere DNA-opbringst.
● Sellen revestearje yn in passende buffer
Sammele sellen wurde dan resuspendeare yn in gaadlike buffer. In gewoane kar is in Tris - EDTA (te) buffer, dat helpt de yntegriteit fan 'e DNA te behâlden tidens it ekstraksjeproses. De buffer tsjinnet meardere doelen: it stabiliseart de pH, chelitaat Divalent-katten dy't DNA oars koe degradearje DNA, en leveret in optimale ionyske omjouwing foar folgjende enzymatyske reaksjes.
Sintrifugaasje nei pelletzellen
● Parameters foar sintrifugaasje (snelheid en tiid)
Nei it resusearjen fan 'e sellen wurdt de skorsing ûnderwurpen oan sintrifluis om de sellen te pellet. Sintrifugaasje snelheid en tiid binne krityske parameters. Typysk wurdt sintrifugaasje útfierd om 4.000 - 6.000 G foar 10 - 15 minuten om 4 ° C. Dit soarget derfoar dat de sellen in strakke pellet foarmje oan 'e ûnderkant fan' e sintrifuge buis.
● belang fan juste pelleting
Juste pelleting is essensjeel om de sellen te skieden fan 'e groei medium en oare oplosberkomponsinten. In goed - Foarme pellet makket de folgjende stappen makliker en effisjinter, soargje foar minimaal ferlies fan sellen en, dêrom maksimaal DNA-opbringst.
Ferwidering fan SuperNatant
● techniken foar ferwidering fan Supernatant
Sadree't de sellen wurde pelleted, moat de supernatant (de floeistof boppe it pellet) foarsichtich wurde fuorthelle sûnder de selpellet te fersteuren. Dit wurdt normaal dien mei in mikroplet. It is krúsjaal om dizze stap foarsichtich út te fieren om alle sellen te ferliezen.
● Soargje foar minimaal ferlies fan selpellet
Soargje derfoar dat minimaal ferlies fan 'e selpellet soarget foar soarchfâldich pipetting en, as nedich, meardere rondes fan sintrifluis en Supernatant ferwidering. It doel is om safolle mooglik sellen mooglik te hâlden yn 'e pellet foar maksimaal DNA-herstel.
Tafoeging fan Nuclei Lission-oplossing
● Komponinten fan Nuclei Lysysoplossing
De Nuclei Lissamloss befettet typysk in wasmiddel (lykas SDS), in buffer (lykas Tris - HCL), en in chelearders (lykas EDTA). De wasmiddel fersteurt de selvrie en nukleêre envelope, de sellulêre ynhâld frijlitte, ynklusyf DNA, yn 'e oplossing.
● rol yn it brekken fan selmuorren
De Nuclei Lissamlissops lyseart net allinich it sel-membraan, mar ferdwynt ek protoriseart protureart en lipiden, effektyf de selmuorren en nukleêre enveloppen brekke om DNA yn te lossen.
Resuspsje fan sellen
● sêfte pipetting om DNA-skuor te foarkommen
Sadree't de Nuclei Lysysoplossing wurdt tafoege, moatte de sellen sêft wurde resuffended om DNA-skuor te foarkommen. Shearing kin de DNA brekke yn lytsere fragminten, dy't problematysk kin wêze foar downstream-applikaasjes dy't heech binne - Molecular - Gewicht DNA nedich.
● Soargje foar folsleine resuspensje
Folsleine resuspenfjinne soarget derfoar dat alle sellen unifoarm binne lyseare, maksimalisearjen fan DNA-herstel. Dit kin wurde berikt troch sêfte pipetting of vortexing de oplossing op in lege snelheid.
Ynkubaasje om kearen te lyse
● Temperatuerynstellingen foar ynkubaasje
De resuspendeare sellen wurde op in spesifike temperatuer op in spesifike temperatuer om folsleine lysis te garandearjen. Dit wurdt normaal dien by 37 ° C oant 55 ° C. De krekte temperatuer en doer kin ferskille, ôfhinklik fan it protokol en de spesifike easken fan 'e DNA-isolaasjekit brûkt.
● Duration fereaske foar effektive lysis
De typyske doer foar ynkubaasje is tusken 20 oant 30 minuten, mar it kin oanpast wurde op basis fan 'e effisjinsje fan it waarnommen fan' e effisjint. Lange inkubaasje kin nedich wêze foar folsleine lysjen, mar moatte balansearre wurde tsjin it risiko fan DNA degradaasje.
Koelje oant keamertemperatuer
● belang fan stadige koeling
Nei ynkubaasje wurdt de lysaat stadichoan ôfkuolle oant keamertemperatuer. Gradual koel helpt by it stabilisearjen fan 'e DNA en minimeart it risiko fan thermyske skok, dy't de DNA potinsjeel koe.
● Effekten op DNA en sellulêre ôffal
Koelje oant keamertemperatuer lit de sellulêre ôffal om te delslach te meitsjen, it makliker te meitsjen om de DNA te skieden yn 'e folgjende stappen. Dit helpt ek de enzyme-aktiviteiten te stabilisearjen en it ferwiderjen fan RNA te fasilitearjen fan RNA troch Rnase-behanneling.
Tafoeging fan rnase-oplossing
● Doel fan rnase yn 'e proseduere
Rnase-oplossing wurdt tafoege oan Degrade RNA, dy't oars koe - CO - Surify mei de DNA en ynterferearje mei ôffal fan ôffal. Rnase selektyf digests rna, wêrtroch't it dna yntakt ferlit.
● foarkomme fan RNA-fersmoarging
Foarkom dat RNA-besmetting is krúsjaal foar applikaasjes dy't suver DNA fereaskje, lykas PCR en sequencing. De rnase-behanneling soarget foar dat de isolearre DNA is frij fan RNA-kontaminanten.
Sreiniging fan DNA
● Metoaden foar it skieden fan DNA fan oare sellulêre komponinten
Ferskate metoaden kinne brûkt wurde om DNA te reinigjen fan 'e Lysate. Dizze omfetsje fenol - Chloroform-extraksje, Ethanol-delslach, en brûk kommersoanlik E. Coli Dna Kits. Elke metoade hat syn foar- en neidielen, mei kommersjele kits dy't gemak en konsistente resultaten oanbiede.
● Sykwurden foar DNA-suverens
Purity is in krityske faktor foar it sukses fan applikaasjes fan ûnderstream fan streamôfwerts. Kommersjele Kits, lykas de selterrêchy E. coli DNA-kit, binne ûntworpen om hege te leverjen fan hege - HACE oplevere troch proteïnen, lipiden te ferwiderjen, en oare kontaminen.
Opslach en ôfhanneling fan isolearre DNA
● Bêste praktiken foar it bewarjen fan DNA
Ienris suvere, soe DNA moatte wurde opslein yn in gaadlike buffer, lykas te buffer, om te wurkjen, om 15 ° C of - 80 ° C For Long - Term opslach. Foarkom faak befrieze - THAW-syklusen as se kinne DNA degradaasje kinne feroarsaakje.
● Beheind DNA-yntegriteit foar applikaasjes fan 'e streamôfwerts
Om DNA-yntegriteit te behâlden, brûk sterile, nuklease - Fergese buizen en oplossingen. Dit soarget derfoar dat de DNA bliuwt ungewoane en geskikt foar applikaasjes lykas klonen, sequencing, en PCR.
OerBluekit
Jiangsu HillGene oprjochte syn haadkantoar (10.000㎡ GMP-planten en R & D-sintrum) yn Suzhou, Suzhou, Suzhou, in Lakhou, in Lakesh-siden yn Shenzhen en Shanghai, it útwreidjen fan har fabrikaazje. De Noard-Karolina-side yn 'e FS is op it stuit ûnder konstruksje, ferspriede fierder syn wrâldwide oanwêzigens. HillGene hat in eksprespaad boud foar it ûntwikkeljen fan sellulêre terapy-produkten, fan levering, mei platfoarms foar platfoarms foar nukleïsume acid-fabrikaazje, Serum - Fergese oanwêzich kultuer, sluten prosesûntwikkeling, en QC-test. Bluekit-produkten binne ûntworpen foar kwaliteitskontrôle, soargje oan it sukses fan sellulêre terapy ynnovaasjes.
Posttiid: 2024 - 09 - 05 - 05:47:03
