DNA: n eristäminen E. colista on perustavanlaatuinen menettely molekyylibiologiassa. Tämä artikkeli opastaa sinut koko prosessin läpi tarjoamalla yksityiskohtaisia vaiheita ja selityksiä varmistaen, että ymmärrät sekä tieteen että menettelyn käytännön näkökohdat. Olitpa kokenut tutkija tai uusi tulokas laboratorioon, tämä opas on arvokas resurssi.
Solususpension valmistelu
● E. coli -solujen kokoelma
Ensimmäinen vaihe E. colin DNA: n eristämisessä sisältää bakteerisolujen keräämisen. Tämä vaatii yleensä E. colin kasvattamista sopivassa nestemäisessä väliaineessa, kunnes se saavuttaa logaritmisen kasvuvaiheen. Ajoitus on ratkaisevan tärkeä, koska tämän vaiheen solut ovat elinkelpoisimpia ja helpommin lalsi, mikä johtaa suurempaan DNA -satoon.
● Solujen uudelleenlähetys sopivaan puskuriin
Kerätyt solut suspendoivat sitten sopivaan puskuriin. Yleinen valinta on Tris - EDTA (TE) -puskuri, joka auttaa ylläpitämään DNA: n eheyttä uuttamisprosessin aikana. Puskuri palvelee useita tarkoituksia: se stabiloi pH: n, kelaatit kaksiarvoiset kationit, jotka muuten voisivat hajottaa DNA: ta ja tarjoaa optimaalisen ionisen ympäristön seuraaville entsymaattisille reaktioille.
Sentrifugointi pellettisoluihin
● Sentrifugoinnin parametrit (nopeus ja aika)
Solujen uudelleen suspendoinnin jälkeen suspensio sentrifugoidaan solujen pellettiin. Sentrifugoinnin nopeus ja aika ovat kriittisiä parametreja. Tyypillisesti sentrifugointi suoritetaan noin 4000 - 6 000 g 10: n ajan 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Tämä varmistaa, että solut muodostavat tiukan pelletin sentrifugiputken pohjalle.
● Oikean pelletin merkitys
Oikea pelletti on välttämätöntä solujen erottamiseksi kasvualustasta ja muista liukoisista komponenteista. Kaivo - Muodostettu pelletti tekee seuraavista askeleista helpompaa ja tehokkaampaa, mikä varmistaa solujen minimaalisen menetyksen ja siten maksimaalisen DNA -saannon.
Supernatantin poistaminen
● Tekniikat supernatantin poistamiseksi
Kun solut on pelletoitu, supernatantti (pelletin yläpuolella oleva neste) on poistettava huolellisesti häiritsemättä solupellettia. Tämä tehdään yleensä käyttämällä mikropipettiä. On välttämätöntä suorittaa tämä vaihe huolellisesti, jotta vältetään solujen menettäminen.
● Solupelletin minimaalisen menetyksen varmistaminen
Solupelletin minimaalisen menetyksen varmistaminen sisältää huolellisen pipetoinnin ja tarvittaessa useita sentrifugoinnin ja supernatantin poistamisen kierroksia. Tavoitteena on pitää niin monta solua kuin mahdollista pelletissä maksimaalisen DNA: n palautumisen saavuttamiseksi.
Ytimien hajotusliuos
● Ytimen hajotusliuoksen komponentit
Ydinhajotusliuos sisältää tyypillisesti pesuainetta (kuten SDS), puskurin (kuten Tris - HCl) ja kelatoivan aineen (kuten EDTA). Pesuaine häiritsee solukalvon ja ydinkuoren vapauttaen solujen sisällön, mukaan lukien DNA, liuokseen.
● Rooli soluseinien hajottamisessa
Ytimen hajotusliuos ei vain hajottaa solukalvoa, vaan myös denaturoi proteiineja ja lipidejä, hajottaen tehokkaasti soluseinät ja ydinverhot vapauttamaan DNA: ta liuokseen.
Solujen uudelleensuspensio
● Hellävarainen pipetointi DNA: n leikkaamisen välttämiseksi
Kun ytimen hajotusliuos on lisätty, solut on suspendoitava uudelleen varovasti DNA: n leikkaamisen välttämiseksi. Leikkaus voi hajottaa DNA: n pienempiin fragmentteihin, jotka voivat olla ongelmallisia alavirran sovelluksille, jotka vaativat korkeaa - molekyyliä - paino -DNA.
● Täydellinen uudelleensuspensio
Täydellinen uudelleensuspensio varmistaa, että kaikki solut ovat hajoamassa tasaisesti, maksimoimalla DNA: n palautumisen. Tämä voidaan saavuttaa lempeällä pipetoimalla tai pyörryttämällä liuosta alhaisella nopeudella.
Inkubointi lyse -soluihin
● Inkubaation lämpötila -asetukset
Suspendoituja soluja inkubidaan tietyssä lämpötilassa täydellisen hajoamisen varmistamiseksi. Tämä tehdään yleensä 37 ° C - 55 ° C. Tarkka lämpötila ja kesto voivat vaihdella protokollan ja käytetyn DNA: n eristyspakkauksen erityisvaatimuksista riippuen.
● Tehokkaan hajoamiseen tarvittava kesto
Inkubaation tyypillinen kesto on välillä 20-30 minuuttia, mutta sitä voidaan säätää havaittujen solujen hajoamisen tehokkuuden perusteella. Pitkäaikainen inkubointi voi olla välttämätöntä täydellisen hajoamisen varalta, mutta sen tulisi olla tasapainossa DNA: n hajoamisriskiä vastaan.
Jäähdytys huoneenlämpötilaan
● asteittaisen jäähdytyksen merkitys
Inkuboinnin jälkeen lysaatti jäähdytetään vähitellen huoneenlämpötilaan. Asteittainen jäähdytys auttaa stabiloimaan DNA: ta ja minimoi lämpö sokin riski, joka voi mahdollisesti heikentää DNA: ta.
● Vaikutukset DNA: hon ja solun roskat
Jäähdytys huoneenlämpötilaan sallii solujen roskat saostumaan, mikä helpottaa DNA: n erottamista seuraavissa vaiheissa. Tämä auttaa myös stabiloimaan entsyymiaktiivisuuksia ja helpottaa RNA: n poistamista RNaasikäsittelyllä.
RNase -liuoksen lisääminen
● RNaasin tarkoitus menettelyssä
RNaase -liuos lisätään hajoamis -RNA: han, joka muuten voisi CO - puhdistaa DNA: lla ja häiritä alavirran sovelluksia. RNase sulattaa selektiivisesti RNA: n jättäen DNA: n ehjiksi.
● RNA -saastumisen estäminen
RNA -kontaminaation estäminen on ratkaisevan tärkeää sovelluksille, jotka vaativat puhdasta DNA: ta, kuten PCR ja sekvensointi. RNaasikäsittely varmistaa, että eristetty DNA ei ole RNA -epäpuhtauksia.
DNA: n puhdistus
● Menetelmät DNA: n erottamiseksi muista solukomponenteista
Useita menetelmiä voidaan käyttää lysaatin DNA: n puhdistamiseen. Näitä ovat fenoli - kloroformin uutto, etanolin saostuminen ja kaupallisten E. coli -DNA -sarjojen käyttäminen. Jokaisella menetelmällä on edut ja haitat, ja kaupalliset sarjat tarjoavat mukavuutta ja johdonmukaisia tuloksia.
● DNA: n puhtauden näkökohdat
Puhtaus on kriittinen tekijä loppupään sovellusten onnistumiselle. Kaupalliset sarjat, kuten soluterapia E. coli DNA -pakkaus, on suunniteltu tuottamaan korkean - puhtauden DNA: n poistamalla tehokkaasti proteiinit, lipidit ja muut epäpuhtaudet.
Eristetyn DNA: n varastointi ja käsittely
● Parhaat käytännöt DNA: n tallentamiseen
Kun DNA on puhdistettu, se tulisi varastoida sopivaan puskuriin, kuten TE -puskuriin, - 20 ° C: ssa tai - 80 ° C pitkään - termivarasto. Vältä usein jäätymistä - Sulata syklit, koska ne voivat aiheuttaa DNA: n hajoamista.
● DNA: n eheyden ylläpitäminen alavirran sovelluksissa
Ylläpitää DNA: n eheyttä, käytä steriiliä, nukleaasia - Vapaat putket ja liuokset. Tämä varmistaa, että DNA on edelleen saastumaton ja sopiva sovelluksiin, kuten kloonaamiseen, sekvensointiin ja PCR: ään.
NoinBluekit
Jiangsu Hillgene perusti pääkonttorinsa (10 000 ㎡ GMP -kasvit ja T & K -keskuksen) Suzhoussa, joka sijaitsee Wuzhongin alueella, Suzhou, kauniissa Taihu -järven kaupungissa ja kahdessa Shenzhenin ja Shanghaiin valmistusverkostossa. Yhdysvaltojen Pohjois -Carolinan sivusto on parhaillaan rakenteilla, levittäen edelleen sen maailmanlaajuista läsnäoloa. Hillgene on rakentanut ekspressipeiteä soluterapiatuotteiden kehittämiselle löytöstä synnytykseen, jossa on alustoja nukleiinihappojen valmistukseen, seerumin - Vapaa suspensioviljely, suljetun prosessin kehittäminen ja QC -testaus. BlueKit -tuotteet on suunniteltu laadunvalvontaan, mikä varmistaa soluterapiainnovaatioiden onnistumisen.
Viestin aika: 2024 - 09 - 05 14:47:03
