جداسازی DNA از E. coli یک روش اساسی در زیست شناسی مولکولی است. این مقاله شما را در کل فرایند طی می کند و مراحل و توضیحات مفصلی را ارائه می دهد ، و اطمینان می دهد که هم علم و هم جنبه های عملی رویه را درک می کنید. این که آیا شما یک محقق فصلی هستید یا تازه وارد آزمایشگاه هستید ، این راهنما یک منبع ارزشمند خواهد بود.
تهیه سیستم تعلیق سلول
● مجموعه سلولهای E. coli
اولین قدم در جداسازی DNA از E. coli شامل جمع آوری سلولهای باکتریایی است. این معمولاً نیاز به رشد E. coli در یک محیط مایع مناسب دارد تا اینکه به مرحله رشد لگاریتمی برسد. زمان بندی بسیار مهم است زیرا سلولهای موجود در این مرحله قابل استفاده ترین و آسان تر برای لیز هستند که منجر به عملکرد DNA بالاتر می شود.
● سلولهای مجدداً در یک بافر مناسب تعلیق می شوند
سلولهای جمع آوری شده سپس در یک بافر مناسب به حالت تعلیق در می آیند. یک انتخاب مشترک یک بافر Tris - EDTA (TE) است که به حفظ یکپارچگی DNA در طی فرآیند استخراج کمک می کند. بافر چندین هدف را ارائه می دهد: pH را تثبیت می کند ، کاتیونهای دوتایی کلات را که در غیر این صورت می توانند DNA را تخریب کنند ، تثبیت می کند و یک محیط بهینه یونی را برای واکنش های آنزیمی بعدی فراهم می کند.
سانتریفیوژ به سلولهای گلوله
● پارامترهای سانتریفیوژ (سرعت و زمان)
پس از تعلیق در سلول ها ، سیستم تعلیق در معرض سانتریفیوژ برای گلوله سلول ها قرار می گیرد. سرعت و زمان سانتریفیوژ پارامترهای مهم است. به طور معمول ، سانتریفیوژ در حدود 4000 - 6000 گرم به مدت 10 - 15 دقیقه در 4 درجه سانتیگراد انجام می شود. این تضمین می کند که سلول ها در انتهای لوله سانتریفیوژ یک گلوله محکم تشکیل می دهند.
● اهمیت گلوله مناسب
گلوله مناسب برای جدا کردن سلول ها از محیط رشد و سایر مؤلفه های محلول ضروری است. یک گلوله چاه - مراحل بعدی را آسانتر و کارآمدتر می کند و از از بین رفتن حداقل سلول ها و در نتیجه حداکثر عملکرد DNA اطمینان حاصل می کند.
حذف مایع رویی
● تکنیک های حذف رویی
پس از گلوله سلولها ، مایع (مایع بالای گلوله) باید بدون ایجاد اختلال در گلوله سلول با دقت برداشته شود. این کار معمولاً با استفاده از میکروپیپت انجام می شود. انجام این مرحله با دقت برای جلوگیری از از دست دادن هر سلول بسیار مهم است.
● اطمینان از حداقل از دست دادن گلوله سلولی
تضمین حداقل از بین رفتن گلوله سلولی شامل پیپت دقیق و در صورت لزوم ، چندین دور از سانتریفیوژ و حذف مایع رویی است. هدف این است که هرچه بیشتر سلول ها را در گلوله برای حداکثر بازیابی DNA نگه دارید.
افزودن محلول لیز هسته
● مؤلفه های محلول لیز هسته
محلول لیز هسته به طور معمول حاوی مواد شوینده (مانند SDS) ، یک بافر (مانند Tris - HCl) و یک عامل چلات (مانند EDTA) است. این مواد شوینده غشای سلولی و پاکت هسته ای را مختل می کند و محتوای سلولی از جمله DNA را به محلول آزاد می کند.
● نقش در تجزیه دیواره های سلولی
محلول لیز هسته نه تنها غشای سلولی را لیز می کند بلکه پروتئین ها و لیپیدها را نیز دناتوره می کند ، و به طور موثری دیواره های سلولی و پاکت های هسته ای را تجزیه می کند تا DNA را در محلول آزاد کند.
تعلیق سلول ها
● پیپتینگ ملایم برای جلوگیری از برش DNA
پس از افزودن محلول لیز هسته ، سلولها برای جلوگیری از برش DNA باید به آرامی مجدداً تعلیق شوند. برش می تواند DNA را به قطعات کوچکتر تقسیم کند ، که می تواند برای برنامه های پایین دست که به DNA وزن زیاد - مولکولی - نیاز دارند ، مشکل ساز باشد.
● اطمینان از تعلیق کامل
تعلیق کامل تضمین می کند که همه سلول ها به طور یکنواخت لیز می شوند و بازیابی DNA را به حداکثر می رسانند. این امر می تواند با پیپت ملایم یا گرداب محلول با سرعت کم حاصل شود.
جوجه کشی به سلولهای لیز
تنظیمات دما برای جوجه کشی
سلولهای مجدداً در یک دمای خاص انکوبه می شوند تا از لیز کامل اطمینان حاصل شود. این کار معمولاً در دمای 37 درجه سانتیگراد تا 55 درجه سانتیگراد انجام می شود. درجه حرارت و مدت زمان دقیق بسته به پروتکل و الزامات خاص کیت جداسازی DNA در حال استفاده متفاوت است.
● مدت زمان لازم برای لیز مؤثر
مدت زمان معمولی جوجه کشی بین 20 تا 30 دقیقه است ، اما می توان آن را بر اساس کارآیی لیز سلول مشاهده شده تنظیم کرد. جوجه کشی طولانی مدت ممکن است برای لیز کامل لازم باشد اما باید در برابر خطر تخریب DNA متعادل باشد.
خنک کننده به دمای اتاق
● اهمیت خنک کننده تدریجی
پس از جوجه کشی ، لیزات به تدریج در دمای اتاق خنک می شود. خنک کننده تدریجی به تثبیت DNA کمک می کند و خطر شوک حرارتی را به حداقل می رساند ، که به طور بالقوه می تواند DNA را تخریب کند.
● اثرات روی DNA و بقایای سلولی
خنک کننده به دمای اتاق اجازه می دهد تا بقایای سلولی رسوب شود و باعث می شود DNA در مراحل بعدی جدا شود. این همچنین به تثبیت فعالیت های آنزیم و تسهیل حذف RNA با درمان RNase کمک می کند.
افزودن راه حل RNase
● هدف RNase در روش
محلول RNase برای تخریب RNA اضافه می شود ، که در غیر این صورت می تواند با DNA پاک شود و در برنامه های پایین دست دخالت کند. RNase به طور انتخابی RNA را هضم می کند و DNA را دست نخورده می گذارد.
● جلوگیری از آلودگی RNA
جلوگیری از آلودگی RNA برای برنامه هایی که به DNA خالص مانند PCR و توالی نیاز دارند بسیار مهم است. درمان RNase تضمین می کند که DNA جدا شده از آلاینده های RNA عاری است.
تصفیه DNA
● روشهای جدا کردن DNA از سایر اجزای سلولی
روش های مختلفی را می توان برای تصفیه DNA از لیزات استفاده کرد. اینها شامل استخراج فنل - کلروفرم ، بارش اتانول و استفاده از کیت های تجاری DNA E. coli است. هر روش جوانب مثبت و منفی خود را دارد و کیت های تجاری راحتی و نتایج مداوم را ارائه می دهند.
● ملاحظات مربوط به خلوص DNA
خلوص یک عامل مهم برای موفقیت برنامه های پایین دست است. کیت های تجاری ، مانند کیت DNA سلول درمانی E. coli ، به گونه ای طراحی شده اند که با از بین بردن موثر پروتئین ها ، لیپیدها و سایر آلاینده ها ، DNA خلوص بالا را به دست می آورند.
ذخیره و دست زدن به DNA جدا شده
● بهترین روشها برای ذخیره DNA
پس از تصفیه ، DNA باید در یک بافر مناسب مانند TE بافر ، در - 20 درجه سانتیگراد یا - 80 درجه سانتیگراد برای ذخیره طولانی - ذخیره شود. از یخ زدگی مکرر از چرخه های ذوب خودداری کنید زیرا می توانند باعث تخریب DNA شوند.
● حفظ یکپارچگی DNA برای برنامه های پایین دست
برای حفظ یکپارچگی DNA ، از استریل ، نوکلئاز - لوله ها و راه حل های رایگان استفاده کنید. این تضمین می کند که DNA بدون آلودگی و مناسب برای برنامه هایی مانند کلونینگ ، توالی و PCR باقی مانده است.
در موردرنگ آبی
Jiangsu Hillgene دفتر مرکزی خود را (10،000㎡ گیاهان GMP و مرکز تحقیق و توسعه) در سوژو ، واقع در منطقه Wuzhong ، Suzhou ، یک شهر دریاچه ای از دریاچه زیبای تایوهو و دو سایت تولیدی در شنزن و شانگهای ، تأسیس کرد و شبکه تولید آن را گسترش داد. سایت کارولینای شمالی در ایالات متحده در حال حاضر در دست ساخت است و بیشتر حضور جهانی خود را گسترش می دهد. Hillgene یک مسیر صریح برای تولید محصولات درمانی درمانی ، از کشف تا زایمان ، با سکوهایی برای تولید اسید نوکلئیک ، سرم - کشت تعلیق رایگان ، توسعه فرآیند بسته و آزمایش QC ایجاد کرده است. محصولات BlueKit برای کنترل کیفیت طراحی شده اند و از موفقیت نوآوری های درمانی سلولی اطمینان حاصل می کنند.
زمان پست: 2024 - 09 - 05 14:47:03
