E. Coli-ren DNA isolatzea funtsezko prozedura da biologia molekularrean. Artikulu honek prozesu osoan zehar ibiliko zaitu, urrats eta azalpen zehatzak eskainiz, prozeduraren zientzia eta alderdi praktikoak ulertzen dituzula ziurtatuz. Sareko ikertzailea edo laborategi berria zaren ala ez, gida hau baliabide baliotsua izango da.
Zelulen esekidura prestatzea
● E. COLI zelulen bilduma
E. Coli-ren DNA isolatzeko lehen urratsa bakterioen zelulak biltzea dakar. Normalean, E. Coli hizkuntza likido egokian haztea eskatzen du, hazkunde logaritmikoko fasera iritsi arte. Denboralekua funtsezkoa da fase honetako zelulak bideragarriak eta errazagoak direlako, eta horrek DNAren errendimendu handiagoa izango du.
● Zelulak berrezartzea bufferra egoki batean
Bildutako gelaxkak bufferra egokian berpizten dira. Aukera arrunta TRIS - EDTA (TE) bufferra da, eta horrek ADNaren osotasuna mantentzen laguntzen du erauzketa prozesuan. Bufferrak hainbat helburu eskaintzen ditu: PHa, Chelates Cations-ek, bestela, DNA degradatu zezakeen eta ingurune ioniko optimoa eskaintzen du ondorengo erreakzio entzimatikoetarako.
Zentrifugazioa pellet zeluletara
● Zentrifugaziorako parametroak (abiadura eta ordua)
Zelulak berrezarri ondoren, esekidura zentrifugazioaren menpe dago zelulak pellet-era. Zentrifugazio abiadura eta denbora parametro kritikoak dira. Normalean, zentrifugazioa 4.000 - 6.000 g inguru egiten da 10 - 15 minutu 4 ºC-tan. Horrek ziurtatzen du zelulek zentrifugatzaile hodiaren behealdean pelleta estu bat osatzen dutela.
● Pelleting egokiaren garrantzia
Pelleting egokia ezinbestekoa da zelulak hazkunde ertaineko eta beste disolbagarrien osagaietatik bereiztea. Putzu bat - eratutako pellet-ek ondorengo urratsak errazten ditu eta eraginkorragoak dira, zelulen gutxieneko galera eta, beraz, DNAren etekin handiena ziurtatuz.
Supernatantak kentzea
● Supernatantak kentzeko teknikak
Zelulak pelleted, supernatantak (pelletaren gaineko likidoa) arretaz kendu behar dira zelula pellet trabarik gabe. Normalean mikropipeta erabiltzen da. Garrantzitsua da urrats hori zorrotz egitea zelula galtzea saihesteko.
● Zelulen pellet galera minimoa bermatzea
Zelularen pelletaren galera minimoak ziurtatzea, hoditeria zaindua eta, beharrezkoa izanez gero, zentrifugazio eta supernatantak kentzea dakar. Helburua da pelleten ahalik eta zelula gehien mantentzea DNA berreskuratzeko gehienez.
Nukleo lisy soluzioa gehitzea
● Nukleo lisiaren soluzioaren osagaiak
Nukleo lisiaren soluzioak normalean detergente bat (SDS bezala) du, bufferra (adibidez, tris - hcl) eta agente chelating bat (EDTA bezala). Detergenteak zelulen mintza eta gutunazal nuklearra desegiten ditu, zelulen edukia askatuz, DNA barne, soluzioan.
● Zelulen hormak apurtzeko eginkizuna
Nukleo Lises soluzioak zelularen mintza lisatzen du, baina proteinak eta lipidoak ere deszentratzen ditu, zelulen hormak eta gutun-azal nuklearrak modu eraginkorrean apurtzen ditu DNA irtenbidea askatzeko.
Zelulen berretsia
● Hoditeria leuna DNA Zizaila saihesteko
Nukleo Lisy soluzioa gehitzen denean, zelulak poliki-poliki berpiztu behar dira, DNA zizaila saihesteko. Zizailak DNA zatitxo txikiagoetan hautsi dezake, eta horrek altua behar duten motxilak - Pisua DNA - Molekular -
● Baldintza osoa bermatzea
Baldintza osoak ziurtatzen du zelula guztiak uniformeki lisatuta daudela, DNA berreskuratzea maximizatzea. Abiadura baxuan irtenbide leuna edo zurrunbilo leuna lor daiteke.
Inkubazioa Lyse Zeluletara
● Inkubaziorako tenperatura ezarpenak
Zehaztu-zelulak tenperatura jakin batean inkubatzen dira, lissis osoa ziurtatzeko. Normalean 37 ºC-tan 55 ºC-tan egiten da. Tenperatura eta iraupen zehatza alda daiteke protokoloaren eta erabiltzen ari den DNA isolamendu kitaren eskakizun espezifikoen arabera.
● Lisy eraginkorra lortzeko beharrezkoa den iraupena
Inkubaziorako iraupen tipikoa 20 eta 30 minutu artean dago, baina ikusitako zelulen lisiaren eraginkortasuna oinarritzat hartuta doitu daiteke. Inkubazio luzea beharrezkoa izan daiteke lisi osorako, baina DNA degradazioaren arriskuaren aurka orekatu behar da.
Giro tenperaturara hoztea
● Hozteko mailakatzearen garrantzia
Inkubazioaren ondoren, lisatua pixkanaka hozten da tenperaturara. Pixkanaka hozteak DNA egonkortzen laguntzen du eta shock termikoaren arriskua minimizatzen du, eta horrek DNA degradatu dezake.
● DNA eta zelulen hondakinak efektuak
Giroaren tenperaturara hozteak aukera ematen du zelulen hondakinak prezipitatzeko, ADNak ondorengo pausoetan bereiztea errazten du. Horrek entzimaren jarduerak egonkortzen laguntzen du eta RNase tratamenduaren bidez RNA kentzea errazten du.
RNase soluzioa gehitzea
● Prozeduran rnasa xedea
RNase soluzioa RNA degradatuari gehitzen zaio, bestela CO - DNArekin garbitu eta downstream aplikazioak oztopatu ditzake. RNASE Sellibly Digests RNA digeritzen du, DNA bere horretan utziz.
● RNA kutsadura prebenitzea
ARN kutsadura prebenitzea funtsezkoa da DNA purua behar duten aplikazioetarako, hala nola PCR eta sekuentziazioa. RNase tratamenduak ADN isolatua RNA kutsatzaileetatik libre dagoela ziurtatzen du.
ADNaren arazketa
● DNA beste zelulen osagaietatik bereizteko metodoak
Hainbat metodo erabil daitezke DNA lisatatik garbitzeko. Horien artean, fenolak - kloroformaketa erauzketa, etanol prezipitazioak eta E. Coli DNA kit komertzialak erabiliz. Metodo bakoitzak bere alde eta kontra ditu, komertzial kitak erosotasuna eta emaitza koherenteak eskaintzen ditu.
● DNA garbitasunaren inguruko gogoetak
Purutasuna faktore kritikoa da downstream aplikazioen arrakastarako. Merkataritza-kitak, hala nola, zelula terapia E. Coli DNA Kit, Garbitasun ADNa egiteko diseinatuta daude, proteinak, lipidoak eta bestelako kutsatzaileak modu eraginkorrean kenduz.
ADN isolatuaren biltegia eta manipulazioa
● DNA gordetzeko jardunbide egokiak
Behin araztua, ADNa bufferra egokian gorde behar da, TE bufferra bezala, - 20 ° C edo - 80 ° Crako denbora luzez - epe luzerako. Saihestu maiz izoztea - Deskonektatu zikloak DNA degradazioa eragin dezaketen moduan.
● DNA osotasuna mantentzea downstream aplikazioetarako
DNA osotasuna mantentzeko, erabili antzua, nukleasa - doako hodiak eta irtenbideak. Horrek ziurtatzen du DNA kanalamendurik gabe jarraitzen duela eta klonazioa, sekuentziazioa eta PCR bezalako aplikazioetarako egokia dela.
Ei buruzUrkur
Jiangsu Hillgenek Suzhou-ko (10.000㎡ GMP Landare eta I + G zentro) sortu zituen, Suzhou, Suzhou barrutian, Suzhou, Lakeshore Taihu lakuko aintzira eta Shenzhen eta Shanghai-ko bi manufakturako bi gune fabrikazio sarea luzatuz. AEBetako Ipar Carolina gunea eraikitzen ari da, gaur egun bere presentzia globala zabaltzen. Hillgene-k espresio bide bat eraiki du terapia zelularreko produktuak garatzeko, aurkikuntzara bidaltzeko, azido nukleikoen fabrikaziorako plataformak, serum - doako esekidura laborantza, prozesuen garapen itxia eta QC probak egiteko plataformak. Bluekit produktuak kalitate kontrolerako diseinatuta daude, terapia zelularraren berrikuntzak arrakasta ziurtatuz.
Post ordua: 2024 - 09 - 05 14:47:03
