DNA eraldamine E. colist on molekulaarbioloogia põhiprotseduur. See artikkel tutvustab teid kogu protsessist, pakkudes üksikasjalikke samme ja selgitusi, tagades, et mõistate protseduuri nii teadust kui ka praktilisi aspekte. Ükskõik, kas olete kogenud teadlane või labori uustulnuk, on see juhend väärtuslik ressurss.
Raku suspensiooni ettevalmistamine
● E. coli rakkude kogumine
Esimene samm DNA eraldamisel E. colist hõlmab bakterrakkude kogumist. See nõuab tavaliselt E. coli kasvatamist sobivas vedelas söötmes, kuni see jõuab logaritmilise kasvufaasi. Ajastus on ülioluline, kuna selle faasi rakud on kõige elujõulisemad ja hõlpsamini lühendatavad, mille tulemuseks on suurem DNA saagis.
● resuspendeerivad lahtrid sobivas puhvris
Seejärel resuspendeeritakse kogutud rakud sobivas puhvris. Ühine valik on Tris - EDTA (TE) puhver, mis aitab säilitada DNA terviklikkust ekstraheerimisprotsessi ajal. Puhver teenib mitut eesmärki: see stabiliseerib pH, kelaatide katioonid, mis võivad DNA -d muidu lagundada, ja pakub järgnevate ensümaatiliste reaktsioonide jaoks optimaalset ioonset keskkonda.
Tsentrifuugimine graanulitega
● Tsentrifuugimise parameetrid (kiirus ja aeg)
Pärast rakkude resuspendeerimist allutatakse suspensioon rakkude graanuleerimiseks tsentrifuugimisega. Tsentrifuugimiskiirus ja aeg on kriitilised parameetrid. Tavaliselt viiakse tsentrifuugimine läbi umbes 4000 - 6000 g 10 - 15 minuti jooksul temperatuuril 4 ° C. See tagab, et rakud moodustavad tsentrifuugitoru põhjas tiheda graanuli.
● Nõuetekohase sadestamise tähtsus
Nõuetekohane sade on hädavajalik rakkude eraldamiseks kasvukeskkonnast ja muudest lahustuvatest komponentidest. Kaev - moodustatud pellet muudab järgnevate sammude lihtsamaks ja tõhusamaks, tagades rakkude minimaalse kaotuse ja seetõttu maksimaalse DNA saagise.
Supernatandi eemaldamine
● Supernatandi eemaldamise tehnikad
Kui rakud on sadestunud, tuleb supernatant (graanuli kohal vedelik) ettevaatlikult eemaldada, häirimata raku graanulit. Tavaliselt tehakse seda mikropipeti abil. Rakkude kaotamise vältimiseks on selle sammu hoolikalt teostamine ülioluline.
● Rakugraanuli minimaalse kaotuse tagamine
Rakugraanuli minimaalse kaotuse tagamine hõlmab hoolikat pipeteerimist ja vajadusel mitut tsentrifuugimise vooru ja supernatandi eemaldamist. Eesmärk on hoida graanulis võimalikult palju rakke, et DNA maksimaalne taastumine.
Tuumade lüüsilahuse lisamine
● Tuumade lüüsilahuse komponendid
Tuumade lüüsilahus sisaldab tavaliselt puhastusvahendit (nagu SDS), puhvrit (näiteks Tris - HCl) ja kelaatvat ainet (nagu EDTA). Pesuvahend häirib rakumembraani ja tuumaümbrist, vabastades rakusisalduse, sealhulgas DNA, lahusesse.
● roll raku seinte lagundamisel
Tuumade lüüsilahus mitte ainult ei lükka rakumembraani, vaid denatureerib ka valke ja lipiide, lõhkudes tõhusalt rakuseinad ja tuumaümblused, et vabastada DNA lahusesse.
Rakkude resuspensioon
● Õrn pipeteerimine, et vältida DNA nihutamist
Kui tuumade lüüsilahus on lisatud, tuleb rakud DNA nihke vältimiseks õrnalt resuspendeerida. Lõikestamine võib DNA jagada väiksemateks fragmentideks, mis võib olla problemaatiline järgneva rakenduste jaoks, mis nõuavad kõrget - molekulaarset - kaal DNA.
● Täieliku elustamise tagamine
Täielik elustamine tagab, et kõik rakud on lüüsitud ühtlaselt, maksimeerides DNA taastumist. Seda saab saavutada õrna pipeteerimise või lahuse keerisemisel madalal kiirusel.
Inkubatsioon Lyse rakkudesse
● Temperatuuri sätted inkubeerimiseks
Resuspendeeritud rakke inkubeeritakse konkreetsel temperatuuril, et tagada täielik lüüsi. Tavaliselt tehakse seda temperatuuril 37 ° C kuni 55 ° C. Täpne temperatuur ja kestus võivad varieeruda sõltuvalt kasutatava DNA eraldamiskomplekti protokollist ja konkreetsetest nõuetest.
● Tõhusa lüüsi jaoks vajalik kestus
Tüüpiline inkubatsiooni kestus on vahemikus 20–30 minutit, kuid seda saab kohandada vastavalt täheldatud raku lüüsi efektiivsusele. Pikaajaline inkubatsioon võib olla vajalik täielikuks lüüsimiseks, kuid see tuleks tasakaalustada DNA lagunemise riskiga.
Jahutamine toatemperatuurini
● Järk -järgulise jahutamise tähtsus
Pärast inkubeerimist jahutatakse lüsaaat järk -järgult toatemperatuurini. Järk -järguline jahutamine aitab DNA -d stabiliseerida ja minimeerib termilise šoki riski, mis võib DNA -d potentsiaalselt lagundada.
● Mõju DNA -le ja raku prahile
Jahutamine toatemperatuurini võimaldab raku prahi sadestuda, hõlbustades DNA eraldamist järgmistes etappides. See aitab ka ensüümide aktiivsust stabiliseerida ja hõlbustab RNA eemaldamist RNASE töötlemisega.
RNaasi lahuse lisamine
● RNase'i eesmärk protseduuris
RNA lagundamiseks lisatakse RNaasi lahus, mis muidu võib DNA -ga puhastada ja häirida allavoolu rakendusi. RNaas seedib selektiivselt RNA -d, jättes DNA puutumatuks.
● RNA saastumise ennetamine
RNA saastumise ennetamine on ülioluline rakenduste jaoks, mis nõuavad puhast DNA -d, näiteks PCR ja sekveneerimine. RNaasi töötlemine tagab, et isoleeritud DNA on RNA saasteainetest vaba.
DNA puhastamine
● Meetodid DNA eraldamiseks teistest rakukomponentidest
DNA puhastamiseks lüsaadist saab kasutada mitmeid meetodeid. Nende hulka kuuluvad fenool - kloroformi ekstraheerimine, etanooli sadestamine ja kommertslike E. coli DNA komplektide kasutamine. Igal meetodil on oma plussid ja miinused, kusjuures kaubanduskomplektid pakuvad mugavust ja järjepidevaid tulemusi.
● DNA puhtuse kaalutlused
Puhtus on järgneva rakenduste edu kriitiline tegur. Kommertslikud komplektid, näiteks rakuravi E. coli DNA komplekt, on loodud selleks, et saada kõrge - puhtus DNA, eemaldades tõhusalt valke, lipiide ja muid saasteaineid.
Isoleeritud DNA ladustamine ja käitlemine
● parimad tavad DNA säilitamiseks
Pärast puhastamist tuleks DNA säilitada sobivas puhvris, näiteks TE -puhver, temperatuuril - 20 ° C või - 80 ° C pikaks - tähtajalise säilitamiseks. Vältige sagedast külmutamist - sula tsüklid, kuna need võivad põhjustada DNA halvenemist.
● DNA terviklikkuse säilitamine allavoolu rakenduste jaoks
DNA terviklikkuse säilitamiseks kasutage steriilset, nukleaasi - vabad torud ja lahused. See tagab, et DNA jääb saastamata ja sobib selliste rakenduste jaoks nagu kloonimine, sekveneerimine ja PCR.
ÜmberBluekit
Jiangsu Hillgene asutas oma peakorteri (10 000㎡ GMP taimed ja R&D Center) Suzhousse, mis asub Wuzhongi rajoonis, Suzhou, kauni Taihu järve järveranniku linnas ja kahes tootmissaidil Shenzhenis ja Shanghais, laiendades selle tootmise võrgustikku. USA Põhja -Carolina sait on praegu ehitamisel, levitades veelgi oma ülemaailmset kohalolekut. Hillgene on ehitanud rakuteraapiatoodete arendamiseks ekspresseeriva raja, alates avastamisest kuni kohaletoimetamiseni, nukleiinhapete tootmiseks mõeldud platvormidega, seerum - vaba vedrustuse kultiveerimine, suletud protsesside arendamine ja QC testimine. Bluekiti tooted on loodud kvaliteedikontrolli jaoks, tagades rakuteraapia uuenduste edu.
Postituse aeg: 2024 - 09 - 05 14:47:03
