Izoli DNA de E. coli estas fundamenta proceduro en molekula biologio. Ĉi tiu artikolo trarigardos vin tra la tuta procezo, provizante detalajn paŝojn kaj klarigojn, certigante ke vi komprenu ambaŭ la sciencon kaj la praktikajn aspektojn de la proceduro. Ĉu vi estas sperta esploristo aŭ novulo al la laboratorio, ĉi tiu gvidilo estos valora rimedo.
Preparo de ĉela suspendo
● Kolekto de E. coli -ĉeloj
La unua paŝo en izolado de DNA de E. coli implikas kolekti la bakteriajn ĉelojn. Ĉi tio kutime postulas kreski E. coli en taŭga likva mezumo ĝis ĝi atingas la logaritman kreskan fazon. La tempolimo estas kerna ĉar ĉeloj en ĉi tiu fazo estas plej fareblaj kaj pli facilaj por lise, kio rezultigos pli altan rendimenton de DNA.
● Resuspendantaj ĉeloj en taŭga bufro
Kolektitaj ĉeloj tiam estas resuspendataj en taŭga bufro. Ofta elekto estas bufro Tris - EDTA (TE), kiu helpas konservi la integrecon de la DNA dum la eltira procezo. La bufro servas multoblajn celojn: ĝi stabiligas la pH, Chelates divalentaj katjonoj, kiuj povus alie degradi DNA, kaj provizas optimuman ionikan medion por postaj enzimaj reagoj.
Centrifugado al peltaj ĉeloj
● Parametroj por centrifugado (rapideco kaj tempo)
Post resendado de la ĉeloj, la suspendo estas submetita al centrifugado por peli la ĉelojn. Centrifuga rapideco kaj tempo estas kritikaj parametroj. Tipe, centrifugado estas farita ĉirkaŭ 4.000 - 6.000 g dum 10 - 15 minutoj je 4 ° C. Ĉi tio certigas, ke la ĉeloj formas streĉan pelton ĉe la fundo de la centrifuga tubo.
● Graveco de taŭga pelado
Ĝusta pelado estas esenca por apartigi la ĉelojn de la kreska mezumo kaj aliaj solveblaj komponentoj. Puto - formita buleto faciligas la sekvajn paŝojn kaj pli efikan, certigante minimuman perdon de ĉeloj kaj tial maksimuman rendimenton de DNA.
Forigo de supernatanto
● Teknikoj por supernatanta forigo
Post kiam la ĉeloj estas pelitaj, la supernatanto (la likvaĵo super la buleto) devas esti zorge forigita sen ĝeni la ĉelan buleton. Ĉi tio kutime fariĝas per micropipette. Estas grave plenumi ĉi tiun paŝon skrupule por eviti perdi iujn ajn ĉelojn.
● Certigi minimuman perdon de ĉela buleto
Certigi minimuman perdon de la ĉela buleto implikas zorgeman pipadon kaj, se necese, multoblajn ĉirkaŭvojojn de centrifugado kaj supernatanta forigo. La celo estas konservi kiel eble plej multajn ĉelojn en la buleto por maksimuma reakiro de DNA.
Aldono de Nuklea Liza Solvo
● Komponentoj de Nuklea Liza Solvo
La solvo de la kerno -lizo tipe enhavas detergenton (kiel SDS), bufron (kiel Tris - HCl), kaj ĉelantan agenton (kiel EDTA). La detergento malhelpas la ĉelan membranon kaj nuklean koverton, liberigante la ĉelajn enhavojn, inkluzive de DNA, en la solvon.
● Rolo en detruado de ĉelaj muroj
La solvo de kernoj ne nur lisas la ĉelan membranon, sed ankaŭ denaturas proteinojn kaj lipidojn, efike detruante la ĉelajn murojn kaj nukleajn kovertojn por liberigi DNA en la solvon.
Resuspensio de ĉeloj
● Milda pipado por eviti tondadon de DNA
Post kiam la solvo de la kerno -lizo estas aldonita, la ĉeloj devas esti resenditaj milde por eviti tondadon de DNA. Tondado povas rompi la DNA en pli malgrandajn fragmentojn, kio povas esti problema por malsuprenfluaj aplikoj, kiuj postulas altan - molekulan - pezan DNA.
● certigante kompletan resuspension
Kompleta resuspensio certigas, ke ĉiuj ĉeloj estas lisitaj unuforme, maksimumigante DNA -reakiron. Ĉi tio povas esti atingita per milda pipado aŭ vortumado de la solvo je malalta rapideco.
Kubado al Lyse -ĉeloj
● Temperaturaj agordoj por kovado
La resuspenditaj ĉeloj estas inkubataj je specifa temperaturo por certigi kompletan lizon. Ĉi tio kutime fariĝas ĉe 37 ° C ĝis 55 ° C. La ĝusta temperaturo kaj daŭro povas varii depende de la protokolo kaj la specifaj postuloj de la izolita ilaro de DNA.
● Daŭro bezonata por efika lizo
La tipa daŭro por inkubacio estas inter 20 ĝis 30 minutoj, sed ĝi povas esti ĝustigita surbaze de la efikeco de ĉela lizo observita. Longedaŭra kovado povas esti necesa por kompleta lizo, sed devas esti ekvilibra kontraŭ la risko de DNA -degenero.
Malvarmigo al ĉambra temperaturo
● Graveco de laŭgrada malvarmigo
Post kovado, la lisato estas iom post iom malvarmetigita ĝis ĉambra temperaturo. Laŭgrada malvarmigo helpas stabiligi la DNA kaj minimumigas la riskon de termika ŝoko, kiu povus eble degradi la DNA.
● Efikoj sur DNA kaj ĉelaj forĵetaĵoj
Malvarmigi al ĉambra temperaturo permesas al la ĉelaj forĵetaĵoj precipiti, faciligante disigi la DNA en la sekvaj paŝoj. Ĉi tio ankaŭ helpas stabiligi la enzimajn agadojn kaj faciligas la forigon de RNA per RNase -kuracado.
Aldono de RNase -solvo
● Intenco de RNase en la proceduro
RNase -solvo estas aldonita por degradi RNA, kiu povus alie kunigi kun la DNA kaj intermiksiĝi kun malsuprenfluaj aplikoj. RNase selektive digestas RNA, lasante la DNA sendifekta.
● Malhelpi RNA -poluadon
Malhelpi RNA -poluadon estas kerna por aplikoj, kiuj postulas puran DNA, kiel PCR kaj sekvencado. La RNase -kuracado certigas, ke la izolita DNA estas libera de RNA -poluantoj.
Purigo de DNA
● Metodoj por disigi DNA de aliaj ĉelaj komponentoj
Pluraj metodoj povas esti uzataj por purigi DNA de la lisato. Ĉi tiuj inkluzivas fenolon - kloroforma eltiro, etanola precipitaĵo, kaj uzado de komercaj E. coli DNA -kitoj. Ĉiu metodo havas siajn pros kaj kontraŭojn, kun komercaj kitoj ofertantaj oportunon kaj konsekvencajn rezultojn.
● Konsideroj pri pureco de DNA
Pureco estas kritika faktoro por la sukceso de malsuprenfluaj aplikoj. Komercaj kitoj, kiel la ĉela terapio E. coli DNA -kit, estas desegnitaj por produkti altan - purecan DNA per efike forigado de proteinoj, lipidoj kaj aliaj poluantoj.
Stokado kaj uzado de izolita DNA
● Plej bonaj praktikoj por stoki DNA
Fojo purigita, DNA devas esti stokita en taŭga bufro, kiel TE -bufro, ĉe - 20 ° C aŭ - 80 ° C por longa - termino -stokado. Evitu oftajn frostajn ciklojn, ĉar ili povas kaŭzi DNA -degeneron.
● Subteni DNA -Integrecon por Malaltaj Aplikoj
Por konservi DNA -integrecon, uzu senfruktan, nuklease - senpagajn tubojn kaj solvojn. Ĉi tio certigas, ke la DNA restas nekontaminita kaj taŭga por aplikoj kiel klonado, sekvencado kaj PCR.
PriBluekt
Jiangsu Hillgene establis sian ĉefsidejon (10.000㎡ GMP -plantoj kaj R & D -centro) en Suzhou, situanta en la distrikto Wuzhong, Suzhou, urbo Lakeshore de la bela lago Taihu, kaj du fabrikaj lokoj en Shenzhen kaj Ŝanhajo, etendante sian fabrikan retan nacion. La loko de Norda Karolino en Usono estas nuntempe en konstruo, plue disvastigante sian tutmondan ĉeeston. Hillgene konstruis espriman vojon por disvolvi ĉelajn terapiajn produktojn, de malkovro ĝis liverado, kun platformoj por fabrikado de nukleaj acidoj, serumo - senpaga kulturado de suspendo, fermita procezo -disvolviĝo kaj QC -testado. BlueKit -produktoj estas desegnitaj por kvalito -kontrolo, certigante la sukceson de ĉelaj terapiaj novigoj.
Afiŝotempo: 2024 - 09 - 05 14:47:03
